工业微生物菌株质量评价 拉曼光谱法 GBT 38569-2020.pdf

GB/T38569-2020工业微生物菌株质量评价拉曼光谱法1范围本标准规定了用拉曼光普法评价工业微生物菌株质量的方法。本标准适用于工业发酵用细菌、真菌、微藻等相对于参考菌株的质量一致性评价。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实险室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3.1工业微生物菌株质量评价performance evaluation of industrial microorganism strain利用拉曼光谱法开展工业微生物菌株质量一致性评价。3.2参考菌株reference strain发酵性能明确，用于发酵生产的经过鉴定的保存菌株。4原理细胞内部化合物拉曼光谱的叠加信息可以反映该细胞的综合表型，通过比较待评价菌株与参考茵株单细胞拉曼光谱的相似性，可以判断待评价菌株是否具有与参考菌株可比较的发酵性能。5试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的二级水。5.1无菌培养基按照菌种类型配制，或选用相应商品化培养基。5.2载玻片氟化钙载玻片(25mm75mm)。6仪器设备试验中所使用的仪器设备为：GB/T38569-2020a)显微拉曼光谱仪：光谱分辨率不低于5cm1,拉曼位移波数范围至少包含400cm11850cm-1:b)培养箱，c)摇床；d)离心机。7测定步骤7.1菌株活化根据生产工艺配制工业微生物相应的固体平板和液体培养基，用无菌接种环分别蘸取参考菌株和待评价菌株的保种菌液，在固休平板上划线，根据生产工艺参数选择相应的温度等条件进行培养，直至长出单菌落：分别挑取3个参考菌株和3个待评价菌株单菌落，接种至含有5L液体培养基的试管中，根据生产工艺参数选择相应的温度和转速，培养至对数期。7.2菌株培养用微量移液器分别移取活化后的参考菌株和待评价菌株各200L,分别接种至3个含有20L液体培养基的容器中，根据生产工艺参数选择相应的温度和转速，培养至稳定期。7.3样品前处理7.3.1分别移取培养后的参考菌株和待评价菌株各1mL至无菌管中。7.3.2选择相应的转速高心，弃掉上清，加入1L无菌双蒸水，混匀菌体。7.3.3按照7.3.2重复2次，移取10L菌液，至无菌管中，加入990L无菌双蒸水，混匀，移取2L稀释后的菌液，在洁净的氟化钙载玻片上点样，无菌环境下室温风干。7.4测量7.4.1将风干后的氟化钙载玻片置于显微拉曼光谱仪载物台上，在透射式明场模式下选择单个细胞，切换至光谱采集模式，测定拉曼光谱信号。7.4.2每个样本随机选取至少20个单细胞作为样品信号。7.4.3在点样区内，采集3个无细胞处信号，并计算平均值，作为背景信号。7.5数据处理7.5.1对单细胞拉曼光谱原始数据进行背景信号扣除（样品信号成去背景信号）、基线校正(5阶函数)和基于面积的归一化处理。7.5.2计算信噪比，其中信号采用1001m1处的尖锐拉曼峰对应的信号强度，舍弃信噪比小于3的数据，补充数据个数，使得待评价菌株组和参考菌株组具有相同的数据个数。8结果计算和分析8.1结果计算8.1.1余弦距离按式(1)计算：GB/T38569-2020之(a:b)cose(a,b)=-9(1）(a:)2X(b)2式中：一单细胞a与单细胞b的拉曼光谱向量的夹角：cos0(a,b)一单细胞a与单细胞b的拉曼光谱余弦距离：一单细胞a拉曼位移i对应的强度；N一单细胞b拉曼位移：对应的强度。计算余弦距离的平均值和标准偏差，并以细胞数为横坐标，以变异系数为纵坐标作图，若曲线达到平台，说明细胞数已足够，若曲线未达到平台，则增加单细胞拉曼光谱采集个数，直至饱和为止。8.1.2相似度按式(2)计算：rB-rwR=m(m-1D74式中：R一待评价菌株和参考菌株的相似度；一待评价菌株每个细胞与参考菌株每个细胞的拉曼光谱余弦距离的平均值：一待评价菌株组内每个细胞之间拉曼光谱余弦距离的平均值：刀一待评价菌株组内单细胞个数。计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留三位有效数字。8.2结果分析R值越小说明待评价菌株与参考菌株越相似，在重复性条件下获得的3次独立实验R值均小于0.05时，判定待评价菌株与参考菌株发酵性能一致。