工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法 GBT 38568-2020.pdf

GB/T38568-2020工业微生物菌株生长表型测定微液滴浊度法1范围本标准规定了用微液滴浊度法测定工业微生物菌株生长表型的方法。本标准适用于工业发酵用细菌、真菌和微藻菌株生长表型测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1参考菌株reference strain发酵性能明确，用于发酵生产的经过鉴定的保存菌株。4原理通过微流控芯片产生单细胞包裹液滴，并培养，根据液滴中的菌体面积，进行生长速率的计算。5试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯。5.1水符合GB/T6682规定的二级水。5.2基础培养基按GB/T14926.43给出的方法配制。或选用商品化的预制培养基，严格按照商品说明书加水配制，5.3PBS缓冲液，pH7.4称取磷酸二氢钾(KH,PO,)0.27g、磷酸氢二钠(Na,HPO,)1.42g、氯化钠(NaCI)8g、氯化钾(KC)0.2g,将上述各成分加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定1GB/T38568-2020容到1L。5.4超低融点琼脂糖凝胶点为817。5.5氟碳油。含有表面活性剂。6仪器设备6.1恒温箱：1，6.2离心机：500g4000g,6.3倒置显微镜：带成像模块。6.4聚四氟乙烯导管：内径0.5mm,6.5PDMS微流控芯片：高度为100m,后面连接有至少50个培养腔室结构，每个腔室尺寸为1.5mm1mm。油相两侧线性结构相同，每一侧长为29.2mm,宽度为40m:水相的线性结构长为4.54mm,究度为60m。6.6分光光度计。6.7热板。7测定步骤7.1菌株活化7.1.1按GB/T14926.43给出的方法配制工业微生物相应的固体平板和液体培养基，用无菌接种环分别藏取参考菌株和待评价菌株保种菌液，在固体平板上划线，根据生产工艺参数选择相应的温度和pH值，进行培养，直至长出单菌落：分别挑取3个参考菌株和3个待评价菌株单菌落，接种至含有5mL液体培养基的试管中，根据生产工艺参数选择相应的温度和转速，培养至对数期。7.1.2从活化的平板培养皿挑取微生物菌株单克隆于5mL液体培养基的容器中，根据生产工艺参数选择相应的温度和转速，培养至稳定期，去除上清后加入PBS溶液，重复清洗3次。7.2微生物菌液浓度选取用基础培养基稀释得到细胞悬液浓度约为6X105CFU/mL。7.3琼脂糖溶液制备用分析天平称取0.02g超低熔点琼脂糖置于无菌EP管中，并向其中加入1mL已灭菌的基础培养基，加热溶解，配制成2%（质量浓度）的溶液。趁热用022m的无菌滤头过滤，现用现配。7.4单细胞液滴发生7.4.1各取500L微生物菌液和琼脂糖溶液等体积混匀。7.4.2取一块芯片，分别在芯片的油相人口加入200L氟碳油和水相人口加入100L低熔点琼脂糖菌液，将注射器与芯片出口相连。7.4.3将芯片放在热板上（温度稳定性士1，范围在3037），将注射器的活塞固定在2mL刻2