化学品 小鼠可遗传易位试验方法 GBT 21798-2008.pdf

GB/T21798-2008化学品小鼠可遗传易位试验方法1范围本标准规定了小鼠可遗传易位试验的范围、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。本标准适用于检测化学品对雄性小鼠诱发可遗传给子代的染色体相互易位的能力。2试验基本原则小鼠可遗传易位试验用来检测小鼠子一代生殖细胞中染色体结构和数目的变化。该试验系统用来检则染色体相互易位，如果子代是堆性，还要检测X染色体丢失情况。染色体易位和X0堆性鼠都说明小鼠生殖能力下降，根据生殖能力选择F代进行细胞遗传学分析。某些类型的易位(X染色体和c1型)可引起小鼠完全不孕不育。F,代雄性鼠或F,代雌性鼠的雄性子代终变期-中期I的减数分裂细胞均可观察到染色体易位：而在X0唯性鼠骨髓细胞的有丝分裂相中，则仅见39条染色体。3试验方法3.1受试样品受试物溶于等渗盐溶液中。非水溶性受试物可溶于或悬浮于适当的赋形剂中，受试物应在使用前新鲜配制。如果使用赋形剂助溶，则赋形剂不应干扰受试物的特性，也不能产生毒作用。3.2试验动物为方便限养和便于细胞学验证，试验选用小鼠。对小鼠品系无特殊要求。但要求所用品系的平均窝仔鼠应大于8只，且相对稳定。应选用健康、性成熟的动物。3.3动物数量动物数量根据自发易位频率和阳性结果需要的最低诱导率而定。本试验通过分析雄性下，代完成，每个剂量水平至少精500只F,代雄性鼠。如果包括睢性F,代，则需要300只维性和300只唯性。3.4对照对照资料必须充分，可以采用平行对照和历史对照。同一实验室近期的可用阳性结果可以代替试验的平行阳性对照。3.5剂量水平通常把能产生极小毒作用但不影响生殖行为且不造成死亡的最高剂量作为试验剂量。为了建立剂量反应关系，还需另设两个低剂量组。对于无毒受试物，使用染毒所能达到的最高剂量。3.6染毒途径常用的染毒途径为经口灌胃和腹腔注射，也可用其他合适的途径。采用与人暴露途径一致的方式染毒，所得的试验结果对危险度评价最有效。3.7操作步聚3.7,1处理和交配有两种染毒方法，最常用的为一次染毒法：也可采用每周7d,连续35d染毒法。根据染毒方法确定染毒后交配的次数，以保证每一阶段染毒精细胞有同等受孕机会。在交配结束时，雌鼠要单笼饲养。记录雌性鼠分娩的时间、窝产仔鼠数和子鼠性别。除试验要求外，应弃去堆性鼠；所有的维性子代饲养至断奶。3.7.2易位杂合试验有两种方法可用：1GB/T21798-2008一F,子代生殖试验初筛和细胞遗传学分析检测可能的易位携带者：一不通过生殖试验初筛，直接用细胞遗传学方法检测所有的维性下，子代。3.7.2.1生育试验通过窝产仔鼠数和/或雌鼠子宫内容物来判断F,代个体的生殖能力是否下降。鉴定生殖能力正常或者下降的标准必须建立在所用的小鼠品系基础上。仔鼠数目观察：每只F,代雌性鼠分别与该试验的雌性鼠或者同一批的摊性鼠同笼。交配后第18天开始每天规察。记录F2代子鼠出生时的数量和性别，然后丢弃。如果使用堆性F,代进行试验，数目较少的F:代仔鼠可以用来进一步试验。细胞遗传学分析雄性后代的易位来检测雌性易位携带者的易位情况。XO雌性鼠可通过后代的雄性：雌性比由1：1变成1：2来辨认。在随后的试验中，如果F:代仔鼠达到或者超过了预先制定的正常值，那么F,代动物视为正常，不需要进一步的试验，否则要观察第二窝或者第三窝下2代仔鼠。如果观察了三窝F:代动物仍不能确认F代动物是否正常，则需要进行雌性鼠子宫内容物分析或者直接进行细胞遗传学分析。子宫内容物分析：由于部分胚胎死亡，染色体易位携带者产仔数减少。因此，试验中子宫植入物死亡数增高是染色体易位的表现。每只F,代雄性鼠与2只一3只未交配过的雕性鼠交配，每日清晨通过观察阴栓判断雌性鼠受学情况。受字后14d16d,处死雌性鼠，记录子宫内存活胎数和吸收胚胎数。3.7.2.2细胞遗传学分析使用空气-干燥技术进行试验前准各。观察到2个以上终变期-中期I的初级精母细胞出现多价体结构即可确认受试动物是易位携带者。如果没有做喂养选择，那么所有F,代雄性都要做细胞遗传学分析。每只雄性鼠显微镜下至少记录25个终变期-中期I细胞。睾丸减小或者终变期前减数分裂终止的F,代雄性鼠，以及怀疑为XOF:代堆性鼠，都需要观察精原细胞或者骨髓细胞有丝分裂中期相。10个细胞出现异常的长和/或短的染色体即是维性不育易位(c型)。某些由X-染色体易位引起维性鼠不育只能通过有丝分裂染色休的显带进行分析鉴定。在10个细胞有丝分裂相中都观察到39条染色体即为XO堆性鼠。4试验数据和报告4.1结果处理数据应以表格形式提交。记录每次交配的雌性鼠产仔和断奶时的平均F,代仔鼠数及仔鼠性别比例。为评价F代动物生殖能力，要列出正常交配动物的窝仔平均数和每只下代易位携带动物的窝仔数。对于子宫内容物分析，要列出正常鼠交配后胎鼠存活和植入死亡的平均值以及每只F代易位携带者的胎鼠存活和植入死亡数。终变期-中期I的细胞遗传学分析，要列出每只易位携带者的多价体结构的数目和类型以及细胞总数。对于不育的F代个体，要列出交配次数和交配时间，案丸重量和细胞遗传学分析的详细资料。对于XO雌性鼠，要列出F,代平均窗仔数、性别比例和细胞遗传学分析结果。如果可能，通过生殖试验筛出F,代易位携带者。表格必须列出证实为易位杂合子的数目。应同时给出阴性对照和阳性对照的数据。4.2结果评价如果至少在一个剂量水平观察到可重复的且具有统计学意义的易位率增加，或易位常的增加与受试物剂量的增加有相关性且具有统计学意义，则试验结果可判断为阳性：否则应认为该受试物在本测试系统中的结果为阴性。