肥胖母鼠对雄性子代生殖力的影响及其机制研究_尹睿.pdf

1 0 9CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 3 月第 35 卷第 2 期收稿日期：2022-08-09；修订日期：2023-02-16基金项目：重庆市自然科学基金重点项目(cstc20220jcyj-zdxmX0011)；重庆市科研机构绩效激励引导专项项目(cstc2021jxjl130017)；重庆市自然科学基金博士后基金(cstc2020jcyj-bsh0238)作者信息：尹睿，E-mail：。*通信作者，李练兵，E-mail：；卢大儒，E-mail：肥胖母鼠对雄性子代生殖力的影响及其机制研究尹睿1，2，岳小枫2，4，谭小音2，李练兵2，*，卢大儒2，3，*(1西南大学医学研究院生殖医学研究中心，重庆400715；2重庆市人口和计划生育科学技术研究院/国家卫生健康委出生缺陷与生殖健康重点实验室，重庆400020；3复旦大学生命科学学院，上海200438；4重庆医科大学附属第三医院泌尿外科，重庆401120)Effects of obese female miceon fertility of male offspringand its mechanismYIN Rui1,2,YUE Xiaofeng2,4,TAN Xiaoyin2,LI Lianbing2,*,LU Daru2,3,*(1.Reproductive Medicine Research Center,Medical Research Institute,Southwest University,Chongqing 400715;2.Key Laboratory of BirthDefects and Reproductive Health of National Health Commission,ChongqingPopulation and Family Planning Science and Technology Research Institute,Chongqing 400020;3.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai200438;4.Department of Urology,The Third Affiliated Hospital ofChongqing Medical University,Chongqing 401120,China)【摘要】目的：探讨母体肥胖小鼠对雄性子代生殖能力的影响及其可能机制。方法：以高脂饮食诱导8周建立雌性小鼠肥胖模型，分别与正常饮食雄性小鼠合笼，子鼠出生后分为母体肥胖组和正常对照组，断奶后正常饮食喂至8周，每组随机选取8只雄性子鼠麻醉后处死，分离睾丸和附睾组织，检测精子质量，ELISA法检测睾丸性激素水平，免疫荧光法检测睾丸活性氧(ROS)水平，qPCR和Western blot法分别检测FOXO1、Nrf2基因的mRNA和蛋白表达水平。结果：与对照组相比，母体肥胖组小鼠精子浓度、精子活力和前向运动精子比率均显著降低(P0.01)，精子畸形率显著升高(P0.01)。其他检测结果显示，母体肥胖能引起子代睾丸组织损伤，睾丸内性激素分泌紊乱，睾丸组织ROS水平升高，精原细胞标志物FOXO1表达水平显著上升，氧化应激水平和Nrf2蛋白表达水平均升高(均为P0.01)。结论：在母体肥胖的情况下，子代雄性小鼠睾丸组织存在氧化应激，可能导致精原细胞分化障碍，引起子代生殖损伤。【关键词】母体肥胖；雄性子代；精原细胞；精子发生；叉头转录家族O1中图分类号：R589.2文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)02-0109-07doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.02.005【ABSTRACT】OBJECTIVE：To investigate effects of obese female mice on reproductive ability of maleoffspring and their possible mechanisms.METHODS：A female mouse obesity model was established byhigh-fat diet induction for 8 weeks，and caged with normal diet male mice.After birth，the offspring weredivided into maternal obesity group and normal control group and fed with normal diet until 8 weeks afterweaning.From each group of mice，8 male offspring were randomly selected and executed after anesthesia.From them，testes and epididymis tissues were isolated，sperm quality was evaluated，testicular sex hormonelevels were detected by ELISA，testes were analyzed using by immunofluorescence Expression levels of mRNAand protein for FOXO1 and Nrf2 genes were detected by qPCR and Western blot，respectively.RESULTS：Compared with the control group，sperm concentrations，sperm motilities and forward motion sperm ratios weresignificantly lower(P0.01)and the sperm malformation rates were significantly higher(P0.01)in the maternalobese mice.Other test results showed that maternal obesity could cause testicular tissue damage in theoffspring，disturbanceintesticularendocrinehormonesecretion，elevatedtesticulartissueROSlevels，significantly increased expression levels of the spermatogonial marker FOXO1，and elevated oxidative stresslevels and Nrf2 protein expressions(all P0.01).CONCLUSION：Due to maternal obesity，oxidative stresslevels were elevated in testicular tissues of offspring male mice which might have caused impaired theirspermatogonial differentiation and reproductive capacity.【KEY WORDS】maternal obesity；male offspring；spermatogonia；spermatogenesis；FOXO1论著癌变畸变突变1 1 0CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.2023肥胖症是一种由遗传、环境和生活方式共同引起的代谢性疾病，中国人的肥胖率自 2004 年的 3.1%上升至 2018 年的 8.1%1，育龄妇女肥胖率也急剧上升2-3，肥胖已经成为一项严重的公共健康问题。大量文献研究表明，妊娠期肥胖可改变母体代谢，进而影响母体和胎儿的营养传输，诱发子代罹患神经发育障碍、心血管疾病和II型糖尿病等疾病4-6。但目前关于母体肥胖是否影响雄性子代生殖力的研究较少，因此亟待证明母体肥胖对雄性子代生殖力的影响，并阐释其相关机制，从而进行有效的母婴早期干预，以预防出生缺陷，促进母婴健康。精子的数量和质量是衡量男性生育力的主要标准。精子发生是一个精密复杂的过程，在胚胎早期便出现原始生殖细胞，随后发育成为性原细胞后增殖分化成为A型精原细胞，精原细胞的形成是生精过程的起始，在这个过程中极易受到外界因素的影响，而肥胖可打破精子发生过程中的能量平衡，导致精子发生障碍7。既往研究表明，母体肥胖可影响子代性腺发育，打破睾丸内氧化还原平衡，最终导致睾丸内精原细胞线粒体损伤及细胞凋亡8-10。母体肥胖还可导致子代精子中Peg3基因的启动子DNA 甲基化显著升高，更为严重的是母体肥胖能通过精子tRNA将肥胖表型传递给子代11-12。这些研究表明，母体肥胖可能会影响子代生殖系统，而母体肥胖对子代生精过程的影响尚不清楚。因此，本研究通过建立高脂饮食诱导母体肥胖小鼠模型，观察分析母体肥胖对雄性子代睾丸功能的影响和可能机制，为母体肥胖造成子代生殖力下降提供新的线索。1材料与方法1.1实验动物清洁级6周龄C57BL/6J雌性小鼠30只，购于北京思贝福生物技术有限公司(生产许可证号110324220102752384)。在国家卫生健康委出生缺陷与生殖健康重点实验室 SPF 级小鼠饲养室喂养，12 h/12 h 光/暗循环，室温22，湿度30%40%。1.2主要仪器和试剂RNA提取试剂盒，购于南京诺唯赞生物科技公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒、GAPDH购于上海碧云天生物技术有限公司；BSA购于美国Sigma 公司；叉头转录家族O1(forkhead box O1，FOXO1)抗体购于武汉Abclonal生物科技公司、Nrf2抗体购于沈阳万类生物技术公司。A48141 VeritiPro PCR 仪购于美国Thermo Fisher公司；Western SDS-Page电泳仪购于美国Bio-rad公司；低温组织匀浆机购于武汉赛维尔生物科技有限公司；藏夹正置显微镜购于日本奥林巴斯公司。1.3饲料成分小鼠饲料购于北京蕙比特科技有限公司（见表1）。高脂饲料作为诱导肥胖母鼠组饮食，低脂饲料作为低脂母鼠组饮食，实验使用的饲料能够保证实验动物的正常生长发育。1.4方法1.4.1肥胖小鼠模型的建立清洁级C57BL/6J雌性6周龄小鼠30只，适应性喂养1周后，分为低脂饮食组与高脂饮食组。低脂饲料喂食的8只小鼠为基础对照组(n=8)，高脂饮食诱导8周后，将体质量超过基础对照组25%的小鼠归为肥胖组(n=10)。两组雌鼠喂养8周后分别将其与正常雄鼠交配。母体肥胖的子代定义为母体肥胖组，选取不同母体子鼠共8只(n=8)；低脂母体定义为对照组，选取不同母体子鼠共8只(n=8)。保持小鼠自由饮食与饮水，每日定时换水换食，记录每周每只鼠的进食量，定期称量小鼠。1.4.2肥胖雌鼠血糖检测在高脂诱导至第8周时将小鼠禁食12 h后，取尾末梢血进行糖耐量检测。使用强生血糖检测仪记录空腹时血糖，再按照1.5 mg/g腹腔注射20%葡萄糖溶液，于注射后15、30、60和120min时分别记录血糖值。1.4.3精子质量检测子鼠出生8周后，随机挑选8只雄性小鼠，按照1 mL/kg剂量对子鼠腹腔注射5%戊巴比妥，麻醉后眼球取血后快速断颈处死，取出睾丸放入液氮速冻与4%多聚甲醛保存，取出附睾将其放入37 预热好的PBS中充分剪碎，在37 金属浴中恒温孵育30 min，充分游离精子，过滤，留取滤液，表1小鼠饲料组成成分/(g/kg)成分酪