不同肉质桃果实成熟过程中细胞壁相关酶活性变化_高原原.pdf

北方园艺 （）：研究论文第一作者简介：高原原（），女，硕士研究生，研究方向为果树生理与生态。：责任作者：陈海江（），男，硕士，教授，现主要从事桃树栽培生理与生态等研究工作。：基金项目：国家现代农业产业技术体系资助项目（）；河北省重点研发计划资助项目（）。收稿日期：不同肉质桃果实成熟过程中细胞壁相关酶活性变化高 原 原，曹 洪 波，李 东 东，安 佳 乐，张 学 英，陈 海 江（河北农业大学 园艺学院，河北 保定 ；馆陶县农业农村局，河北 邯郸 ）摘要：以软溶质型“霞晖号”、硬溶质型“保佳红”、硬质型“保佳俊”、不溶质型“金童号”桃果实为试材，采用果实细胞壁降解相关酶活性测定方法，研究了不同肉质桃果实成熟过程中硬度、呼吸强度、细胞壁降解相关酶活性及基因 、的表达差异对果实软化的影响，以期阐明不同肉质桃果实成熟过程中细胞壁相关酶活性变化差异。结果表明：软溶质型桃“霞晖号”果胶甲基酯酶（）、纤维素酶（）活性高于其它种肉质类型的桃果实，多聚半乳糖醛酸酶（）活性高于不溶质型桃“金童号”和硬质型桃“保佳俊”，表明、活性与软溶质型桃“霞晖号”软化进程密切相关。种肉质类型的桃果实半乳糖苷酶（）活性差异不显著，表明 不是影响不同肉质类型的桃软化进程的关键因素。种不同肉质类型的桃果实在成熟发育后期 基因相对表达强度整体呈上升趋势，“霞晖号”和“保佳俊”基因相对表达量在整个果实发育后期均呈上升的趋势，酶活性与相关基因表达量变化趋势基本一致。关键词：桃；果实肉质；酶活性；硬度；呼吸强度中图分类号：文献标识码：文章编号：（）桃（）属蔷薇科李属桃亚属植物，原产地为我国西部地区，现在是我国的主要水果之一。根据桃果实果肉质地类型可以把桃分为三大类，即硬质型、溶质型以及不溶质型，溶质型果实按其软化特性又可分为硬溶质型果实和软溶质型果实。果实成熟衰老主要体现为果实软化，桃进入成熟期后，果实硬度逐渐下降，前人研究结果表明，不同果肉类型的桃果实采后的耐贮性和货架期存在明显差异，硬质型和不溶质型桃果实的采后贮藏时间明显优于其它类型的桃果实，而硬溶质桃果实的贮藏时间又普遍长于软溶质桃果实，软溶质果实采后迅速软化。目前对桃果实成熟软化的研究大部分集中在溶质型桃果实上，在果实发育过程中，果实质地和细胞壁组分以及果胶含量有着密切联系，桃作为呼吸跃变型果实，由于其本身呼吸作用的特点而更容易成熟软化，这个过程主要伴随着细胞壁成分尤其是果胶的降解，而果胶的降解是多种结构酶共同作用的结果，因此该研究以软溶质型“霞晖号”、硬溶质型“保佳红”、硬质型“保佳俊”、不溶质型“金童号”桃果实为试材，研究不同肉质类型桃果实在生长发育后期细胞壁降解相关酶活性对桃果实软化进程的影响，以期有助于更 好的了 解 不 同 肉质 类型桃果实成熟软化的机理。材料与方法 试验材料供试材料为软溶质型“霞晖号”、硬溶质型“保佳红”、硬质型“保佳俊”、不溶质型“金童号”果实，采自保定市满城区苗圃场，顺平县坨南果园、腾家庄果园。试验方法桃果实以盛花期天数标记采收成熟度。选取果型端正、果面着色程度一致、质量相近、无病虫害的果实，每隔采一次果，直至果实完全成熟。每个品种选定棵树，每次采果量为 个，带回实验室作为后续试验测定，个桃品种个成熟度果实采收标准见表。表个桃品种个成熟度果实采收标准 品种 成熟度 盛花后天数 外观特征 果皮全绿，果实整体硬 果皮嫩绿泛黄，果实整体硬“金童号”果皮微黄，尖红，果实微软 果皮半黄，片红果实微软 果皮全黄，部分红色，果实微软 果皮青白色，果实整体硬 果皮泛白，尖红，果实整体较硬“霞晖号”果皮底色为白，尖红，果肉微软 果皮底色为白，片红，果实较软 果皮部分着色，果肉极软 果皮底色为青白，有红斑，果实整体硬 果皮底色为白色，片红，果实整体硬“保佳俊”果皮底色为白，着色，果实整体硬 着色，果实整体较硬 着色或全红果实较硬 果皮底色为绿，顶尖着色，果实整体硬 果皮泛白，顶尖着色，果实整体硬“保佳红”果皮底色为白，上半部分着色，果实整体较硬 着色，果实微软 着色，顶部暗红，果实微软 项目测定 果实硬度测定采用 型手持硬度计测定桃果肉硬度，每个果实测定个点。果实呼吸强度测定采用静置碱液吸收法测定，真空泵中放入装有 的 溶液的培养皿，放入个桃果实，盖上盖子，用石蜡密封玻璃干燥器边缘，于室温下（）静置，后将吸收 的 溶液倒入锥形瓶并加入少量氯化钡溶液便于观察变色现象，用草酸滴定培养皿中剩余的 溶液，酚酞指示剂变色后停止滴定，计算培养皿中 溶液对真空泵中 的吸收量。对照真空泵中不放桃果实。多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶（）、纤 维 素 酶（）、半乳糖苷酶（）和果胶甲酸酶（）活性测定参考王哲 方法，称取桃果肉放入研钵中，加入少量氯化钠提取液研磨果肉，将研磨好的桃果肉转移至 离心管，冲洗研钵，冲洗液也一并转入离心管中，将提取液定容至，离心后上清液用于酶活性测定。酶液的提取及活性测定参考 等 的 方 法，以 缓 冲 液（，内含 ，巯基乙醇，聚乙烯吡咯烷酮）为提取液，离心后得到的上清液需过透析膜除去小分子无机盐，以硝基酚半乳糖苷（）为反应底物，反应条件温度控制为 ，时间为，反应时间结束后用 终止反应，波长下测定吸光值，以煮沸酶液作对照。提 取 与 活 性 测 定 参 考 等 方法，稍作改动。将果肉样品放入研钵中并加入 提取液（含有 聚乙二醇和 亚硫酸钠）充分研磨，研磨后放入离心管中用离心机，下 离心 。离心完成后取 上清酶液并及时放入 保鲜冰箱备用。从冰箱取出预提取的酶液，每个样品分 别 取 上清 酶 液 ，加入到含有 果胶溶液的锥形瓶中，混匀后测定，并做好记录，然后放入 光照培养箱中恒温放置北方园艺月（上）待 其 充 分 反 应。反 应 完 成 后 不 断 用 溶液滴定反应液直至反应液 回到原来的水平，此时记录下此过程消耗的 量。酶活性用反应液中的 变化表示，以 每 鲜 样 反 应 消 耗 的酶量为个酶活力单位。相关基因表达量测定使用 提取试剂盒提取桃果肉总，并用琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪检测其完整性和浓度。使用全式金反转录试剂盒合成 反应体系见表。引物合成由通用生物公司完成。该研究中使用的引物根据 发布的相关基因 完整序列用 设计特异性引物，送通用生物公司合成引物（表）。表反转录反应体系 成分 体积 （）（）总体积 表引物序列 正向引物 反向引物 根据模版 的 浓度梯度曲线试验结果可知，当以 模版进行实时荧光定量 反应时，效果最佳。实时荧光定量反应体系见表。表实时荧光定量反应体系 成分 体积 （）（）（）（）总体积 反应循环参数如下：反应程序为 ，退火，个循环；溶 解 曲 线 程 序 为 ，。数据分析采用 软件进行原始数据处理，采用 软件进行数据处理和方差分析。结果与分析注：不同小写字母代表差异显著（）。下同。：（）图不同肉质类型桃果实生长发育过程中硬度变化 生长发育过程中不同肉质桃果实硬度变化从图可以看出，在果实成熟度时种肉质 类 型 的 桃 果 实 硬 度 无 显 著 差 异，均 在第期 北方园艺 左右，在果实成熟度时不同肉质类型桃 果实硬度出现 差异，“保 佳 红”和“霞 晖号”果实硬度显著低于硬质型桃“保佳俊”，“金童号”果 实硬 度 显著 低于“保 佳 红”和“霞晖号”，成熟度时“金童号”和“霞晖号”果实硬度相近，均为 左右。种肉质类型的桃果实在整 个 生 长 发 育 后 期 果 实 硬 度 均表现为下降趋势，果实成熟时“保佳俊”硬度最大，为 ，“霞晖号”硬度最低，为 。生长发育过程中不同肉质桃果实呼吸强度变化果实的呼吸强度是预测果实贮藏潜力的重要指标。由图可知，随着果实成熟度的增加“保佳红”“金童号”“霞晖号”桃果实的呼吸速率先不断升高，其中“金童号”和“保佳红”在果实成熟度时达到峰值，之后快速下降，“霞晖号”在果实成熟度时达到峰值，之后快速下降，“保佳俊”在整个生长发育后期果实呼吸强度均维持在 ，未出现呼吸高峰，“保佳红”“金童号”“霞晖号”最大呼吸强度分别为 、。不同肉质桃果实细胞壁降解相关酶活性变化 不同肉质桃果实多聚半乳糖醛酸酶（）活性变化多聚半乳糖醛酸酶（）是参与果实细胞壁降解的重要酶。由图可知，活性在果实的生长发育过程中呈升高趋势，种肉质类型的桃果实酶活性在活力值和变化幅度上存在差异。在整个果实发育后期，软溶质型桃“霞晖号”果实中 活性均显著高于不溶质型桃“金童号”和“保佳俊”，在果实成熟度、时“保佳红”活性显著低于“霞晖号”；从果实成熟度开始“保佳红”活性开始快速升高，至果实采摘时其 活性达到 ，“保佳俊”在整个果实发育后期 活性基本均显著低于其它种肉质类型的桃品种。基因相对表达量方面，种不同肉质类型的桃果实在成熟发育后期 基因相对表达强度整体呈上升趋势，种不同肉质类型桃果实间 基因变化程度和表达量均有差图不同肉质类型桃果实生长发育过程中呼吸强度变化 图不同肉质类型桃果实生长发育过程中 活性变化 异，且 基因表达量的变化趋势与 活性的变化趋势一致。不同肉质桃果实纤维素酶（）活性变化纤维素酶（）是分解细胞壁纤维素基质多糖的关键酶。由图可知，在桃果实生长发育后期，不同肉质类型的桃果实 活性存在差异。“保佳俊”“保佳红”“金童号”果实 活性随着果实成熟度的增加不断升高，“霞晖号”桃果实 活性在前个时期呈上升趋势，但在成熟度时 活性显著降低。“霞晖号”桃果实 活北方园艺月（上）图不同肉质类型桃果实生长发育过程基因 相对表达量变化 图不同肉质类型桃果实生长发育过程中 活性变化 性在果实成熟度、时显著高于其它个品种，“保佳红”果实 活性在果实成熟度、时显著高于“金童号”和“保佳俊”，“金童号”和“保佳俊”在整个果实生长发育后期果实 活性均无显著差异。不同肉质桃果实果胶甲酯酶（）活性变化及基因相对表达量变化果胶甲酯酶（）可催化降解植物细胞壁中的果胶物质进而破坏细胞壁的完整性，加速果实的软化过程。由图可知，在桃果实生长发育后期，不同肉质类型的桃果实 活性均呈上升趋势，但在酶活力值和变化范围上存在差异。“金童号”“保佳红”“保佳俊”活性在果实成熟后期快速升高，至果实采摘当日 活性分别达到 、，“霞晖号”果实发育后期活性升高速度较其它个品种略微缓慢，但“霞晖号”活性在整个生长发育过程中均显著高于“保佳红”“保佳俊”，在果实成熟度、时显著高于“金童号”。从基 因 相对 表 达 量 来看，“金童号”果 实基因相对表达量在距采果时达到最大值，随后开始下降，“霞晖号”和“保佳俊”基因相对表达量在整个果实发育后期均呈上升的趋势，“保佳红”基因在果实发育后期相对表达量较多且稳定。图不同肉质类型桃果实生长发育过程中活性变化 不同肉质桃果实半乳糖苷酶（）活性变化半乳糖苷酶（）在植物体内的主要作用是降解植物细胞壁中半乳糖残基，加速果胶物质的降解从而加速果实软化。从图可以看出，在桃果实生长发育后期种肉质类型桃果实的 活性均呈上升趋势，其中“霞晖号”活性在果实发育后期高于其它个品种，但是差异不显著；“保佳俊”活性在果实成熟度之后显著低于其它个品种，其酶活性在 。果实硬度与细胞壁降解酶相关性分析从表可以看出，不溶质型桃“金童号”的第期 北方园艺图不同肉质类型桃果实生长发育过程中基因相对表达量变化 图不同肉质类型桃果实生长发育过程中 活性变化 表桃果实硬度与酶活性的相关性 品种 相关系数 “金童号”“霞晖号”“保佳俊”“保佳红”注：表示在 水平下差异显著，表示在 水平下差异极显著。：，果实硬度与果实中、活性呈极显著负相关，与、活性呈显著负相关；软溶质型桃“霞晖号”果实硬度与、活性呈显著负相关，与 活性无相关性关系；硬质型桃“保佳俊”果实硬度与果实中、活性呈极显著负相关，与 、活性呈显著负相关；硬溶质型桃“保佳红”果实硬度与果实中 、活性呈显著负相关，与 活性呈极显著负相关。讨论与结论不同树种以及同一树种不同品种（基因型）间的果实成熟机制存在明显差异。果实采后的软化速率直接影响贮藏寿命和货架期。桃作为呼吸跃变型果实，在成熟过程中最明显的变化就是随着果实成熟度的增加，硬度逐渐下降，一般在呼吸达到顶峰之后果实硬度开始迅速