甘谷二肽的抗氧化活性及氧化损伤的保护作用_刘畅.pdf

收稿日期：作者简介：刘畅（），女，硕士，大豆深加工理论与应用。通信作者：邹险峰（），男，博士，副教授，研究方向为大豆深加工理论与应用。功能与营养甘谷二肽的抗氧化活性及氧化损伤的保护作用刘 畅，张茂迎，赵 淼，郎佳雪，邹险峰（长春大学食品科学与工程学院，吉林长春）摘 要：以 叔丁氧羰基甘氨酸和 三苯甲基谷氨酰胺为原料，以氯甲酸异丁酯为酸酐，采用混合酸酐法合成甘谷二肽，利用红外光谱进行表征，并探究甘谷二肽的还原能力、对、的清除能力及对线粒体和蛋白质氧化损伤的保护作用。结果表明：合成产物在 处出现酰胺键 的伸缩振动，为甘谷二肽；甘谷二肽具有较强的 和清除能力，其 和的 分别为 、，但对 的清除能力及还原能力效果较差；甘谷二肽能够抑制线粒体氧化损伤和蛋白质氧化损伤。关键词：甘谷二肽；抗氧化活性；氧化损伤；谷氨酰胺 ，（，）：(),:;中图分类号：文献标志码：文章编号：（）谷氨酰胺是 种条件必需氨基酸，在饥饿、手术及创伤等应激状态下，人体对谷氨酰胺的需求远远超过体内合成谷氨酰胺的能力。但谷氨酰胺溶解度低、稳定性差，限制其在食品行业中的应用。通过酶解法制备谷氨酰胺活性肽可以克服这些缺点。江爱芝采用 种不同方法提取米糠蛋白，通过酶解法制备富含谷氨酰胺的活性肽，谷氨酰胺含量达%；王允华等采用酶解豆粕制备谷氨酰胺活性肽，但其结构和组成不明确。而人工合成的甘谷二肽是 种具有谷氨酰胺的活性肽，水溶性好、稳定性强、低免疫原性，这使其成为有效的谷氨酰胺替代品，且结构和组成明确。甘谷二肽具备谷氨酰胺的许多生理功能，如维持机体氮平衡、保护严重烧伤大鼠心肌功能、保护心肌缺血再灌注损伤等，但关于其抗氧化性的研究鲜有报道。本研究采用液相法合成甘谷二肽，探究甘谷二肽的抗氧化活性及其对蛋白质和线粒体氧化损伤的保护作用，为其功能性食品 年第 卷第 期 粮食与油脂开发提供理论依据。材料与方法 材料与试剂叔丁氧羰基甘氨酸（）、三苯甲基谷氨酰胺（），上海吉尔生化；三氟乙酸（）、二氯甲烷（）等试剂，分析纯。仪器与设备 傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞公司；紫外分光光度计，日本岛津公司。试验方法 甘谷二肽合成步骤将 放入 圆底烧瓶中，在冰浴搅拌下依次加入 四氢呋喃（）、甲基吗啡啉和 氯甲酸异丁酯。后，加入 （）、甲基吗啡啉和 二氯甲烷溶液。继续冰浴搅拌 后，在室温下搅拌反应 。旋蒸后将残留物溶于 乙酸乙酯中洗涤，油相用无水硫酸钠干燥，再旋蒸，向圆底烧瓶中加入 体积分数%的三氟乙酸溶液（），室温下搅拌反应 后，旋蒸后加入乙酸乙酯，旋摇后得到白色沉淀析出，将其真空干燥、纯化得到甘谷二肽。产物表征采用傅里叶红外光谱仪对甘谷二肽进行红外光谱表征，溴化钾压片，记录波数为 。抗氧化活性测定 清除能力根据文献的方法，测定不同浓度甘谷二肽对的清除能力，以谷氨酰胺和维生素 作阳性对照。还原能力的测定根据文献的方法，测定不同质量浓度甘谷二肽的还原能力，以谷氨酰胺作阳性对照。清除能力在试管中分别加入 罗丹明 溶液、溶液、蒸馏水，混匀放置 后，在波长 下进行全波扫描，记录最大峰时吸光度（）。加入同样罗丹明 溶液和 缓冲液，蒸馏水，溶液和 溶液，混匀放置 后，测吸光度（）。加入同样罗丹明 溶液、缓冲液、溶液和 溶液，蒸馏水，不同质量浓度的甘谷二肽溶液，混匀放置 后，测定吸光度（）。维生素 和谷氨酰胺作阳性对照。甘谷二肽的 清率（，%）计算见式（）。%（）清除能力根据文献的方法，测定不同质量浓度甘谷二肽的清除能力，以谷氨酰胺和维生素 作阳性对照。甘谷二肽对 诱导的线粒体氧化损伤影响 牛心线粒体制备根据 等的方法制备牛心线粒体。将 新鲜牛心用生理盐水洗净，放入 的 缓冲液（蔗糖、）中，组织捣碎机捣成匀浆，在 下以 离 心，过滤后取上清液调 至 ，在 下以 离心 ，收集沉淀，重复离心。将沉淀悬浮于上述缓冲液中，放入冰箱 下保存。牛心线粒体损伤体系的建立参照 等的方法，稍作修改。在试管中分别加入 线粒体溶液和 （、），加入 质量浓度 甘谷二肽，将其放在 恒温振荡槽保温，再依次加入 和 ，放入恒温槽振荡并计时，每隔 中取出，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（）的相对含量。波长 处的吸光度间接地反映出线粒体的损伤程度。以不含甘谷二肽、过氧化氢和硫酸亚铁的为对照组，不含甘谷二肽的为损伤组，以谷氨酰胺作阳性对照。甘谷二肽对 诱导蛋白质氧化损伤的影响 蛋白质氧化损伤模型建立在试管中加入 缓冲溶液（其中含有终浓度 氯化铁、过氧化氢和 抗 坏 血 酸）和 不同质量浓度的甘谷二肽溶液，加入 牛血清蛋白（），然后在 恒温水浴氧化。粮食与油脂 年第 卷第 期 羰基含量测定根据 等的方法测定羰基含量，通过测定波长 处吸光度反映羰基的相对含量，间接反映出损伤程度，以谷氨酰胺作阳性对照。数据处理采用 进行数据分析，采用 绘图。结果与分析 甘谷二肽的结构表征由图 可知：处为酰胺键 伸缩振动吸收峰，处为羧酸 伸缩振动吸收峰，处为 伸缩振动吸收峰，处为 面内弯曲振动吸收峰。表明产物中存在的肽键，合成产物为甘谷二肽。图 液相合成甘谷二肽的红外光谱图 浓度对 清除率的影响由图 可知：随着甘谷二肽（）和谷氨酰胺（）浓度的增加，清除率变大。甘谷二肽和谷氨酰胺对 的清除率远低于维生素图 样品浓度对 清除率的影响。这可能与甘谷二肽的供电子能力差有关，也可能由于氧的存在，使得 以 和 种状态存在，而紫外分光光度法只考虑，因此甘谷二肽和谷氨酰胺的清除活性差。质量浓度对还原能力的影响还原能力与抗氧化性呈正相关，其机理为甘谷二肽和铁氰化钾发生氧化还原反应生成普鲁士蓝，在波长 吸光度最优。由图 可知：随着甘谷二肽和谷氨酰胺质量浓度的增大，两者的吸光度变化不大且均趋于，说明其不具备还原能力。可能是因为其供电子能力弱，也可能是因为还原力测定方法本身的生物相关性较低。图 质量浓度对还原能力的影响 质量浓度对 清除率的影响由图 可知：随着质量浓度的增大，甘谷二肽、谷氨酰胺和维生素 对 的清除率均逐渐增大。当质量浓度大于 时，甘谷二肽和维生素 对 的清除率均增长缓慢，而谷氨酰胺质量浓度大于 时，其对 的清除率才趋于稳定，说明甘谷二肽和维生素 低质量浓度就能够有效清除，谷氨酰胺在较高质量浓度清除 的效图 质量浓度对 清除率的影响 年第 卷第 期 粮食与油脂果才明显。甘谷二肽的 为 ，维生素 的 为 ，谷氨酰胺的 为 ，表明甘谷二肽具有较好的 清除效果，可能是由于甘谷二肽能提供氢，可与结合，形成稳定性较强的自由基，从而减少与罗丹明的反应。谷氨酰胺的 清除效果低于甘谷二肽可能是因为谷氨酰胺供氢能力差。质量浓度对清除率的影响清除机理与 一样。由图 可知：随着质量浓度的增大，清除率逐渐变大。维生素 的清除能力几乎达到了%，且较稳定；甘谷二肽的清除率低于维生素 优于谷氨酰胺，其 为 ，谷 氨 酰 胺 的 为 ，说明甘谷二肽的清除能力明显优于谷氨酰胺。谷氨酰胺的清除能力低可能与其水溶性和供氢能力差有关。图 甘谷二肽质量浓度对抑制率的影响 甘谷二肽对 诱导线粒体氧化损伤的影响自由基可引起线粒体 损伤、呼吸链损伤、膜损伤、稳态的破坏等。反应产生，侵害线粒体细胞膜中的不饱和脂肪酸，从而形成丙二醛。由图 可知：随着时间的延长，各组的丙二醛含量均逐渐增加，损伤组和甘谷二肽组以及谷氨酰胺组丙二醛含量明显高于对照组，表明牛心线粒体氧化损伤体系建立成功。与损伤组比较，甘谷二肽组表现出了明显的抑制作用，而谷氨酰胺组与损伤组相同，说明谷氨酰胺没有抑制作用，可能是由于甘谷二肽对丙二醛生成的抑制作用有明显的剂量效应关系，随着时间延长，甘谷二肽的含量逐渐减少。图 不同时间丙二醛生成的含量 甘谷二肽对 诱导蛋白质氧化损伤的影响采用 氧化体系建立蛋白质氧化损伤体系，和抗坏血酸（）反应形成 ，之后再和反应形成，攻击蛋白质的侧链产生羰基化合物。由图 可知：随着质量浓度的增加，甘谷二肽组的羰基含量明显下降，而谷氨酰胺组的羰基含量下降缓慢，当谷氨酰胺质量浓度大于 时，羰基含量不再减少，说明谷氨酰胺对蛋白质的保护作用有限。甘谷二肽对蛋白质的损伤表现出明显的保护效果，当甘谷二肽质量浓度大于 时，羰基很少生成，说明甘谷二肽具有抑制羰基生成的作用。可能是因为甘谷二肽清除了，导致没有过多的 从侧链氨基酸上提取氢原子，使侧链氨基酸的碳没有配对电子，进而不能形成羰基。肖海芳等研究表明提取物的蛋白质氧化损伤保护作用与其直接清除 有关。图 不同质量浓度甘谷二肽的羰基含量 结论甘谷二肽对基于电子转移原理的 清除粮食与油脂 年第 卷第 期能力和还原力效果较差，对基于供氢原理的和清除能力具有较好的清除效果，能够抑制丙二醛的形成和羰基的生成。总之，甘谷二肽具有抗氧化活性，优于谷氨酰胺。研究结果为甘谷二肽的功能食品和营养保健品的研究提供理论支撑。参考文献 ,():任娇艳,林晓,岑月妍,等 富含谷氨酰胺多肽的制备及其体外模拟消化 中国食品学报,():何林玲 富含谷氨酰胺小麦水解蛋白的制备及其性质的研究 武汉:武汉轻工大学,江爱芝 米糠蛋白提取及富含谷氨酰胺肽液的制备研究 长沙:湖南农业大学,王允华,谢岩黎,马成业,等 谷氨酰胺结合肽组成及贮藏稳定性研究 粮食与油脂,():戚仁斌,纪惜銮,熊怡圆,等 甘氨酰谷氨酰胺对缺氧 复氧损伤心肌细胞的保护作用及机制研究 中国药理学通报,():,():,():郭冰冰,蒋新液,裴晶晶,等 谷氨酰胺对高脂饮食诱导 小鼠肥胖和胰岛素抵抗的影响 中国病理生理杂志,():,():,:李颖,曾剑华,李云冰,等 热处理对豆浆总酚含量及其抗氧化能力的影响 食品科技,():,():,:,():,():蔡俊,陈季旺,王茹,等 多肽体外抗氧化活性测定方法的比较 食品科学,():,(),():,:李铉军,崔胜云 抗坏血酸清除 自由基的作用机理 食品科学,():秦修远,陆路,崔欣悦 等 豌豆低聚肽硒螯合物的体外抗氧化作用 中国食品学报,():罗春丽,王林,李杏,等 紫薯花青素体外抗氧化及对 诱导 细胞氧化损伤的保护作用 食品科学,():何亮亮,赵浩安,刘新艳,等 枸杞蜜的抗氧化活性及其对 氧化损伤的保护作用 食品工业科技,():,():（下转第 页）年第 卷第 期 粮食与油脂期洋甘菊总酚质量浓度为 时，总还原力（）、（%）及（%）清除能力 最 强；而 花 苞 期 洋 甘 菊 总 酚 质 量 浓 度 为 时，清除能力最强，达%，与维生素 接近。结论通过分析不同时期洋甘菊的总黄酮、总糖和总酚含量及其体外抗氧化活性，结果表明：不同花期洋甘菊的总黄酮含量分别为花苞期%、半开期%、全开期%；总糖含量分别为花苞期%、半开期%、全开期%；总酚含量分别为花苞期%、半开期%、全开期%；不同花期的洋甘菊提取物均具有一定的体外抗氧化活性，花苞期对 清除率最高可达%；不同时期 的清除率比较稳定，最高分别达到%、%、%；清除率最高分别达到%、%、%；总还原力最高分别达到 、。本试验为洋甘菊合理应用奠定了理论基础。参考文献 ,():,():袁艺,王丹,孙宝新,等 洋甘菊挥发油应用研究 安徽农业科学,():郭玉婷,兰卫 维药洋甘菊提取物对原发性高血压大鼠血压的影响 山东轻工业学院学报(自然科学版),():楚秉泉,方若思,李玲,等 洋甘菊各萃取相抗氧化活性及其有效成分分析 食品工业科技,():陆娟,谢东雪,贺柳洋,等 洋甘菊多糖的分离纯化、性质结构及抗氧化活性分析 食品与发酵工业,():夏娜,陶海燕,赵丽凤 洋甘菊中总糖与总黄酮粗提物抗氧化及抑制亚硝化作用研究 食品工业,():谢东雪 洋甘菊、杭白菊多糖分离纯化及抗氧化活性研究 长春:长春师范大学,赵二芳,王晓妮,张海蓉,等 山楂清除亚硝酸盐及阻断亚硝酸合成的研究 食品与发酵工业,():张纪宁,杨洁 新疆狭叶薰衣草总黄酮的抗氧化活性研究 价值工程,():王亚君 欧李果实总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究 太原:山西大学,齐泊霖 稠李子总酚的提取、纯化及抗氧化活性研究 长春:吉林农业大学,（上接第 页）,():朱淑云,沙莎,秦云云,等 水飞蓟寡肽对小鼠肝线粒体损伤的保护作用 中国粮油学报,():,():肖海芳,付晶晶