复方熊胆茵陈颗粒对代谢相关...HPA轴相关激素影响的研究_王春桔.pdf

实验研究 福建中医药 2023 年 4 月 第 54 卷 第 4 期Fujian Journal of TCM April 2023，54（4）复方熊胆茵陈颗粒对代谢相关脂肪性肝病大鼠HPA轴相关激素影响的研究王春桔1，伍娟1*，楼莹1，杨眉峰1，刘赟1，吴玲2（1.福建中医药大学临床技能教学中心，福建 福州 350122；2.福建中医药大学护理学院，福建 福州 350122）摘要：目的 研究复方熊胆茵陈颗粒（ACF）对代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）大鼠HPA轴相关激素的影响。方法 将51只SD大鼠随机分为模型组11只，正常组、低剂量组、中剂量和高剂量组各10只，正常组给予基础饲料、模型组与各剂量组给予高脂饲料喂养 6周。造模成功后，低、中、高剂量组按体质量 1 mL/100 g分别予4.73、9.46、18.92 g/L复方熊胆茵陈颗粒药液灌胃，正常组和模型组给予2 mL生理盐水灌胃，共4周。取肝脏行HE染色观察5组大鼠肝组织病理变化，取血清检测5组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（CORT）水平，qPCR检测5组大鼠肝组织中CRH、ACTH、CORT mRNA相对表达水平，免疫组化检测5组大鼠肝组织中CRH、ACTH、CORT蛋白相对表达水平。结果 与正常组比较，模型组大鼠肝索排列紊乱，脂肪空泡满视野，累及肝小叶大于50，符合脂肪性肝病病理+级；与模型组比较，各剂量组大鼠肝细胞的脂肪空泡减少，肝索排列整齐，肝小叶清晰可见。与正常组比较，模型组血清ALT、AST、CRH、ACTH、CORT均显著升高（P均0.01）；与模型组比较，各剂量组大鼠血清ALT、AST、ACTH、CORT均显著降低（P均0.01），中、高剂量组大鼠血清CRH均显著降低（P0.05或 P0.01）。与正常组比较，模型组大鼠肝脏 CRH、ACTH、CORT mRNA 相对表达水平均显著升高（P均0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠肝脏CRH、ACTH、CORT mRNA相对表达水平均显著降低（P0.05或0.01）。与正常组比较，模型组大鼠肝脏CRH、ACTH、CORT蛋白相对表达水平均显著升高（P均0.05）；与模型组比较，各剂量组大鼠肝脏CRH、ACTH、CORT蛋白相对表达水平均显著降低（P均0.05）。结论 ACF能够改善MAFLD大鼠肝组织损伤，减少MAFLD大鼠血清及肝组织中CRH、ACTH、CORT的分泌，提示ACF治疗MAFLD的作用机制可能与改善下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱有关。关键词：代谢相关脂肪性肝病；复方熊胆茵陈颗粒；促肾上腺皮质激素释放激素、促肾上腺皮质激素、皮质醇随着人们生活水平的提高、生活习惯和饮食结构的改变，代谢相关脂肪性肝病（metabolic asso-ciated fatty liver disease，MAFLD）发病率呈逐年上升趋势，已成为我国第一大慢性肝病。流行病学调查显示已成为全球常见的慢性肝脏疾病之一，全球患病率在 25%左右，我国患病率高达15%以上1。复方熊胆茵陈颗粒（artemisia capillaris formula，ACF）为福建中医药大学阮时宝教授经典方，是福建中医药大学附属第二人民医院院内制剂（批准文号：闽药制Z20110007）。方中含有熊胆粉、茵陈、山楂、泽泻、白术、柴胡、甘草等中药，具有清肝利湿、疏肝健脾的功效。课题组前期的动物实验证实：ACF能明显改善MAFLD模型大鼠的肝脏脂肪变性和脂滴聚集情况，可通过调控脂代谢关键酶的表达调节脂质代谢，降低肝脏脂肪含量，达到降血脂及治疗脂肪肝的目的2-5。下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）是反应机体应激状态的中枢神经系统，是大脑与肠道之间由神经-内分泌介导的双向应答系统。HPA 轴相关激素促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（CORT）的表达影响肠道屏障功能以及肠道微生物组成和丰度6-8。肠道菌群与MAFLD 的发生、发展密切相关。MAFLD 患者 HPA轴过度激活程度与肝组织病理改变密切相关9。本研究旨在观察ACF对MAFLD大鼠HPA轴相关激素的影响，以进一步明确 ACF 治疗 MAFLD 的作用机制。1实验材料1.1实验动物SPF 级 SD 大鼠 51 只，雄性，体质量（20020）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0002，在福建中医药大学动物实验中心 SPF 级动物实验室适应性喂养1周，实验动物许可证号：SCXK（沪2017-0005）。1.2实验药物制备ACF由福建中医药大学附属第二人民医院药剂科制备，采用水提醇沉法制备浸膏，加入75%辅料制得，每克相当于生药1.314 g。1.3实验仪器超微量分光光度计（美国 Thermo Fisher Scientific公司，型号：NanoDrop2000）；标准试剂型纯水仪（青岛富勒姆科技有限公司，型号：FBZ2001-up-p）；荧光定量 PCR 仪（美国 ABI公司，型号：Stepone plus）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）。收稿日期：2022-12-15基金项目：福建省自然科学基金项目（2019J01364）通信作者：伍娟，E-mail：DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.0400513福建中医药第 54 卷1.4实验试剂10%水合氯醛（永华化学科技有限公司，批号：20181101）；4%多聚甲醛（广州赛国生物科技有限公司，批号：1800122）；苏木素-伊红染色液（批号：180634）、乙二胺四乙酸（批号：G1206）、HRP标记山羊抗兔二抗（批号：GB23303）、免疫组化试剂盒 DAB 显色剂（批号：G1211）、RNA提取液（货号：G3013）、目的基因引物 DNA 均购自赛维尔生物科技有限公司；一抗 CORT（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-14001R）；一抗ACTH（英国 Abcam 公司，批号：Ab74976）；一抗CRH（上海泊湾生物科技有限公司，批号：AY1786）；cDNA合成试剂盒（美国Thermo公司，货号：#K1622）。2实验方法2.1动物造模、分组及给药取雄性SD大鼠51只，体质量（20020）g，随机分为模型组 11 只和正常组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各10只，造模前均适应性饲养1周。正常组给予基础饲料、模型组与各剂量组给予高脂饲料（每 100 g饲料中含有猪油 10%，胆固醇 2%，基础饲料 88%）喂养 6 周。于6 周末随机抽取模型组大鼠 1 只，摘取肝脏，采用HE 染色观察肝脏病理改变，当脂肪性病变肝细胞超过肝小叶 1/3 时提示大鼠 MAFLD 模型造模成功。造模成功后，低、中、高剂量组按1 mL/100 g体质量分别予 4.73、9.46、18.92 g/L ACF药液灌胃，正常组和模型组予生理盐水2 mL灌胃，5组均于上午910时灌胃，每日1次，连续4周。2.2取材取材前一晚禁食，取材当天称重后按0.5 mL/100 g体质量腹腔注射 20%乌拉坦麻醉，迅速开腹，腹主动脉取血。将血液收集在普通采血管内，离心后取其血清，保存于-20冰箱中备用，用于检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、CRH、ACTH、CORT；迅速分离整个肝脏后用无菌生理盐水轻轻漂洗，取右叶肝组织切成约 1 cm1 cm1 cm 大小，以 4%多聚甲醛溶液固定后流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋制成肝组织标本用作病理观察；其余肝组织置于-80 冰箱保存用于qPCR和免疫组化检测。2.3观察指标2.3.1肝组织病理学形态将肝组织石蜡标本切片（厚度为4 m），采用HE染色，中性树脂封片，光镜下观察肝组织病理学形态。2.3.2血清 AST、ALT、CRH、ACTH、CORT 水平测定采用速率法检测血清中 AST、ALT 水平，采用ELISA法检测CRH、ACTH、CORT含量。2.3.3 qPCR 检 测 肝 组 织 中 CRH、ACTH、CORT mRNA相对表达水平提取总 RNA：TRIzol 法提取总RNA，使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度。Primer 6.0 软件设计 CRH、ACTH 的引物（引物序列见表 1），依次加入 4 L 5Reaction Buffer、2 L 10 mmol/L dNTP Mix、1 L RiboLock RNAase 抑制剂（20 U/L）和 1 L RevertAiM-MuLV 逆转录酶（200 U/L），用枪抽吸混匀，于PCR仪上42 保温60 min，结束后 70 保温 5 min 灭活反转录酶。以-actin 为内参照基因，SYBRGreen 实时荧光定量PCR 扩增，扩增体系 20 L。反应条件：95 预变性10 min，40个循环95 变性15 s，60 退火60 s），每 15 s 升温 0.3，具体步骤参见试剂盒说明书。以目的基因相对表达水平作为判断标准，采用2-Ct的方法计算 CRH、ACTH、CORT mRNA相对表达水平。2.3.4免疫组化检测肝组织中 CRH、ACTH、CORT蛋白相对表达水平取大鼠肝组织，依次经 4%多聚甲醛固定、脱水、包埋、切片（厚度8 m），制备成石蜡切片，将石蜡切片脱蜡复水，柠檬酸钠溶液抗原修复，5%BSA 封闭，一抗（CRH 1 200；ACTH 1 200；CORT 1 200）4 孵育过夜，二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水封片，于显微镜下观察拍照。采用 Image pro plus 软件分析 5 组照片的平均光密度值并计算蛋白相对表达水平。2.4统计学方法应用SPSS 23.0统计软件进行数据处理。计量资料符合正态分布以（x s）表示，2组比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.15 组大鼠肝组织病理学形态正常组肝小叶结构正常，肝索排列整齐，肝细胞为多边形，细胞边表1引物序列基因名称-actinCRHACTHCORT引物序列正向：5-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3反向：5-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3正向：5-CCGCTACAACACGACAAACAA-3反向：5-GTAGGATGAAAGCCGAGATGAGG-3正向：5-CAGGACCTCACCACGGAAAG-3反向：5-TCAGTCAAGGGCTGTTCATCTC-3正向：5-TAAGCGGCAGGAAAGACCAC-3反向：5-ACTTGCACGAGGAGAAGGTTT-3引物长度/bp24026611395退火温度/6060606014王春桔 等：复方熊胆茵陈颗粒对代谢相关脂肪性肝病大鼠HPA轴相关激素影响的研究第 4 期界清晰，细胞核明显，未见肝细胞变性、炎性浸润及肝脏组织坏死；模型组肝组织损伤严重，大部分肝小叶结构破坏严重，肝索排列紊乱，大量细胞空泡，图1黑箭头所示处肝细胞胞质肿胀明显，呈气球样变及空泡变性，出现脂肪性肝病病变；低剂量组肝细胞呈放射状排列，细胞核基本清晰，胞质肿胀、空泡变性减少；中剂量组肝细胞呈放射状排列，细胞核位置、形态正常，细胞肿胀减轻，散在少量气球样变及空泡；高剂量组肝索排列整齐，明显改善了肝细胞气球样变和空泡变性。见图1。3.25组大鼠血清ALT、AST、CRH、ACTH、CORT水平比较见表2。3.35 组大鼠肝组织 CRH、ACTH、CORT mRNA 相对表达水平比较见表3。3.45 组大鼠肝组织 CRH、ACTH、CORT 蛋白相对表达水平比较见表4。4讨论中医学认为脂肪肝的病因病机主要为饮食失节、情志内伤、肝脾不