蜂胶中12种酚类化合物含量的测定 液相色谱-串联质谱法和液相色谱法 GBT 19427-2022.pdf

GB/T19427-20225.11标准物质：绿原酸(CAS号：327-97-9)、咖啡酸(CAS号：331-39-5)、p-香豆酸(CAS号：501-98-4)、阿魏酸(CAS号：1135-24-6)、槲皮素(CAS号：117-39-5)、莰菲醇(CAS号：520-18-3)、芹菜素(CAS号：520-36-5)、松属素(CAS号：480-39-7)、短叶松素3-乙酸酯(CAS号：52117-69-8)、柯因(CAS号：480-40-0)、高良姜素(CAS号：548-83-4)和阿替匹林C(CAS号：72944-19-5)，纯度均不低于98%。5.12标准储备液：准确称取适量的标准物质(5.11)，分别用甲醇(5.2)制备浓度为1.0mg/mL的标准储备液，该储备液在一18及以下温度可稳定保存6个月。5.13标准工作溶液：移取适量的标准储备液(5,12)，用甲醇-0.1%甲酸水溶液(5.7)稀释成浓度为0.02g/mL、0.05g/mL、0.1g/mL、0,2g/mL、0.5g/mL、1.0g/mL的混合标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱法检测使用；移取适量的标准储备液(5.12)，用甲醇水溶液(5.6)分别稀释成浓度为1.0g/mL、2.0g/mL、5.0g/mL、10.0g/mL、20.0g/mL、50.0g/mL的混合标准工作溶液，供液相色谱-紫外检测法检测使用。6仪器和设备6.1液相色谱-串联质普仪：配有电喷雾离子源。6.2液相色谱仪：配有紫外（或二极管阵列）检测器。6.3分析天平：感量0.01mg和0.001g。6.4超声波清洗仪。6.5离心机：转速不低于4000r/min。6.6微量可调移液器：量程分别为10L100L和0.1mL1mL。6.7微孔滤膜：0.22m。7分析步骤7.1试样的制备与处理7.1.1试样的制备取混合均匀的代表性蜂胶样品约100g,密封，并做标记。在样品测定前，将被测样品放入10以下冰箱中保持2h后，取出20g30g,迅速用粉碎机粉碎，过孔径约为2mm(10目)的筛，冷藏保存于冰箱中作为待测试样。7.1.2试样的处理称取0.5g(精确至0.001g)试样于50mL塑料离心管中，加15mL乙醇水溶液(5.5)，在室温超声提取20min,在4000r/min下高心10min,上清液转入50mL容量瓶中，按照上述步骤重复提取离心2次，合并上清液，用乙醇水溶液(5.5)定容至50mL,混匀。取上述样品溶液用甲醇水溶液(5.6)适当稀释并混匀后，取部分溶液过0.22m微孔滤膜(6.7)至样品瓶中，供液相色谱仪(6.2)测定；或取上述样品溶液用甲醇-01%甲酸水溶液(5.7)适当稀释后，过0,22m微孔滤膜(6.7)至样品瓶中，供液相色谱串联质谱仪(6.1)测定。7.2测定7.2.1液相色谱-串联质谱参考条件液相色谱-串联质谱仪的液相色谱参考条件如下：a)色谱柱：C18,100mm2.1mm:1.72m或相当者：2GB/T19427-2022b)流动相A:0.1%甲酸水溶液(5.8)：c)流动相B:0.1%甲酸-甲醇溶液(5.9)，梯度洗脱条件参见附录A的表A.1;d)流速：0.25mL/min:e)柱温：30：D进样体积：2L。液相色谱-串联质谱仪的质谱参考条件如下：)扫描方式：正负离子扫描：b)检测方式：多离子反应监测(MRM):c)电喷雾电压：+5500V/-4500V:d)雾化气体气压：0.345MPa:e)气帘气压：0.172MPa:)离子源温度：500；g)去族电压：十100V/-100V:)定量离子对、定性高子对和碰撞能量：参见表1。7.2.2液相色谱参考条件液相色谱仪(6.2)的参考条件如下：a)色谱柱：C18,150mm4.6mm:3.0m或相当者：b)流动相A:1.0%乙酸水溶液(5.10)；)流动相B:甲醇(5.2)，梯度洗脱条件参见表A.2;d)流速：1.0mL/min,c)柱温：35；D进样体积：5Lg)检测波长：12种酚类化合物的定量检测波长参见表1。表1 HPLC-MS/MS离子化模式、定量离子对、定性离子对、碰撞能量及HPLC-UV检测波长定量离子对定性离子对HPLC-UV检测波长/化合物离子化模式碰撞能量V(n/e)(m/x)nm绿原酸负离子（一）352.9/190.9352.9/85.020/52310咖啡酸负离子（一）178.8/134.9178.8/133.920/32310p-香豆酸负离子（一）162.8/118.9162.8/92.920/40310可魏酸负离子（一）192.8/133.9192.8/177.922/18310解皮素负离子（一）300.8/150.9300.8/178.828/24350致非醇正离子（十）287.0/153.0287.0/68.941/79350芹菜素负离子（一）268.9/116.9268.9/150.938/32350松属素正离子（十）257.0/153.0257.0/131.035/40280短叶松素3-乙酸酯负离子（一）312.7/253.0312.7/271.028/26280柯因正离子（十）255.0/153.0255.0/77.045/83280高良姜素正离子（十）271.0/153.0271.0/77.041/73280阿替匹林C负离子（一）299.0/255.0299.0/200.024/283153