甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法 GBT 36820-2018.pdf

GB/T36820-20184.4高速台式冷冻离心机：离心力12000g以上。4.5微量加样器：0.1L2.5L、0.5L10L、2L20L、10L100L、20L200L、50uL1000L。4.6无核酸酶(Nuclease)的1.5mL、2.0mL离心管，PCR反应管、带滤芯Tip头、实时荧光PCR反应管。4.7恒温水浴锅。4.8鼓风干燥箱。4.9冰箱：2一8、-20、一80。4.10生物安全柜。4.11采样工具：欣刀、剪刀、镊子、带槽钻子。5试剂与材料5.1试剂除非另有规定外，在分析中仅使用分析纯试剂，实验用水符合GB/T6682的二级水指标，其中涉及PCR的用水要求达到一级水指标。5.1.1氯仿。5.1.2异丙醇。5.1.3无水乙醇。5.1.4无核酸酶(Nuclease)水。5.1.5裂解液：主要成分为异硫瓶酸弧和苯酚，为RNA提取试剂。5.1.675%乙醇。5.1.7定量荧光PCR检测引物5-引物：5-CGGGAAACCCATAATACCAC-3.3-引物：5-GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3。扩增片段大小为130bp。5.1.8水解型寡核苷酸探针(TaqMan探针)5-FAM-TGCTGCATTGATTTCGTGATGGTG-TAMRA-3.5.1.9用于一步法的荧光反转录聚合酶链式反应混合液包括一步法反转录聚合酶链式反应缓冲液、5-引物、3-引物、水解型寡核苷酸探针(TaqMan探针)、逆转录酶混合液，Ex Tag HS DNA聚合酶等，具体配制方法见附录B。5.2材料5.2.1阳性对照：用已知含甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗样品作阳性对照。5.2.2阴性对照：用已知不含甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗样品作阴性对照。5.2.3空白对照：用无核酸酶的无菌一级水代替样品。6样品的采集与前处理6.1取样工具准备欣刀、剪刀、镊子等取样工具应经121士2、1.1105Pa高压灭菌15min或经160干热灭茵2h。2