甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法 GBT 28067-2011.pdf

GB/T28067-2011与淬灭剂分离，所发出的荧光不再为淬灭剂所吸收而被检测仪所接受。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。5甘蔗黄叶病毒基本信息5.1病毒粒体形态特征甘蔗黄叶病毒粒体为二十面对称体，直径24nm29nm,浮力密度1.30g/cm3,由蛋白质外壳及其包裹着的一条单链、正义的RNA(ssRNA)构成，病毒基因组大小约6kb。5.2寄主范围自然寄主为甘蔗属中的热带种(Saccharum officinarum)、大茎野生种(Saccharum robustum)、中国种(Saccharum sinensis)和制手密(Saccharum sponta1eun）。实验寄主包括蔗茅属(Erianthus sp.)、小麦、燕麦，大麦、水稻、玉米和高粱等。在寄主植株内的分布主要局限于组织韧皮部内。5.3寄主症状田间病症表现为甘蔗叶片中脉黄化，并向两侧扩展，中脉下表皮为鲜黄色，上表皮仍是正常的白色或绿白色，有的染病品种叶片中脉两侧出现红褐色。染病植株叶片从叶尖开始干枯坏死，并向下扩展，严重感病植株叶片发黄、坏死。由甘蔗黄叶病毒引起的这种病害称为甘蔗黄叶病(Sugarcane yellowleaf disease),早期称为甘蔗黄叶综合症(sugarcane yellow leaf syndrome)。5.4分布地区甘蔗黄叶病1989年首次发生在美国夏城夷，随后陆续在美国的弗罗里达州、恋克萨斯州、路易斯安那州以及巴西、澳大利亚、南非、中国、印度等30多个国家和地区出现并不断蔓延扩大。5.5传播途径由甘张蚜虫(Melanaphis sacchari)、甘张绵蚜(Ceratovacuna lanigera)、玉米叶蚜(Rhopalosiphummaidis)和水稻根际蚜虫(Rhopalosiphum rufiabdominalis)传播，也可由感病的种茎传播，但不能通过种子、机械摩擦方式传播。6病毒的分类信息国际病毒分类委员会(ICTV)第8次报告将甘蔗黄叶病毒列入黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)中成员，英文名称为sugarcane yellow leaf virus,缩写为SCYLV,7仪器与设备7.1实时荧光PCR检测系统。7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3电子天平：感量0.01g。7.4高速台式冷冻离心机：离心力12000g以上。GB/T28067-20117.5微量加样器：0.1L2.5L,0.5L10L,5L20L,10L100L,10L200L,100L1000L。7.6无RNA酶的离心管、PCR反应管、Tip头、实时荧光PCR反应管。7.7恒温水浴锅。7.8鼓风干燥箱。7.9冰箱：24，-20，-80。8试剂与材料8.1试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂：所有试剂均用无RNA酶的容器分装。8.1.1三氣甲烷。8.1.2异丙醇。8.1.375%乙醇”。8.1.4无RNase水及双蒸水，8.1.5裂解液：主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，为RNA提取试剂。8.1.65X反转录反应混合液：含5X反转录反应缓冲液、dNTPs、RNase制剂、-MLV反转录酶，具体配制方法参见附录A。8.1.7检测引物5-引物：5-TTCAGTATAACTCATGCTCCTCCG-33.引物：5-ACTTTCTTGGCGTTCCTCTTG-3扩增片段大小为130bp。8.1.8 TaqMan探针：5-FAM-CGCAACTCCAGGTGCAATCGC-TAMRA-3,8.1.9含有EX Taq荧光PCR反应混合液含有2 XEX Taq荧光PCR反应液、5-引物、3-引物、Taq Man探针，具体配制方法参见附录A,8.2材料8.2.1阳性对照：用已知含甘蔗黄川病毒的样品作阳性对照。8.2.2阴性对照：用已知不含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照。9样品的采集与前处理9.1取样工具欣刀、剪刀、镊子等取样工具应经121士2、1.1105Pa高压灭菌15min或经160干烤2h。9.2采样方法9.2.1采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。9.2.2叶片样品：取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶（一1叶）叶片，绵号备用。1)用无RNase水配制，