柑桔溃疡病菌的检疫检测与鉴定 GBT 29394-2012.pdf

GB/T29394-2012录B),通过菌溢检查和革兰氏染色法，可直接进行鉴定；对于有疑似症状的样品，通过病原分离培养和接种试验可进行检验鉴定；间接ELISA检验主要用于疑似症状、不显症样品的检验鉴定；PCR检验主要用于以上两种方法均不能确定时的检验鉴定，有条件的实验室也可直接用于疑似症状、不显症植株的检验鉴定。6仪器及用具6.1症状及病原形态鉴定仪器及用具天平、高压灭菌锅、超净工作台、培养箱、生物显微镜、体式显微镜、解剖刀、接种棒、培养皿、烧杯、载玻片、盖玻片、吸管等。6.2 ELISA检测仪器及用具天平、高速台式离心机、打孔器、微量移液器一套、移液器、酶标板、酶标仪等。6.3PCR检测仪器及用具高速台式离心机、PCR扩增仪、PCR反应管、水平电冰仪、凝胶成像系统、微量移液器一套。7试剂及材料除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。7.1症状及病原形态检测试剂与材料7.1.1无菌水H20。7.1.2革兰氏染色液。7.1.3蔗糖蛋白胨培养基PSA。7.2 ELISA检验试剂与材料7.2.1样品提取液：取1.15g磷酸氢二钠Naz HPO,)、0.2g氯化钾(KC)、0.2g磷酸二氢钾(KH,PO,)、8g痕化钠(NaC)、0,2g叠氨化钠(NaN3),用1000ml,蒸留水溶解，并周整pH值到7.4。7.2.2洗涤液：取1.15g磷酸氢二钠(Na:HPO,)、0.2g氣化钾(KC)、0.2g磷酸二氢钾(KH:PO,)、8g氯化钠(NaCl),0.5g吐温-20，用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4。7.2.3封闭液：取5g无脂奶粉，用100mL样品提取液溶解。7.2.4包被液：取2.93g碳酸氢钠(Na2HCO)、1.59g氯化钠(NaC)、0.2g叠氮化钠(NaN),用1000mL蒸榴水溶解，并调pH值到9.6。7.2.5抗体稀释液：取2.5g脱脂奶粉、加100mL洗涤液溶解。7.2.6抗体：兔抗柑桔溃疡病菌抗体球蛋白。7.2.7酶标抗体：市售碱性磷酸酶标记的羊抗免抗体球蛋白。7.2.8底物缓冲液：用80mL灭菌蒸馏水将0.01g氯化镁(MgC26H.O)、0.02g叠氮化钠(NaN3)、9.7mL二已醇胺(CH:CH2OH)溶解后，调pH值到9.8，定容到100mL。7.2.9底物溶液：将5mg对硝基苯醉酸盐(C。HNO,)溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前10min内，避光条件下制备。7.2.10终止液：将12g氢氧化钠(NaOH),用100mL蒸馏水溶解，