对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程 PCR检测法 GBT 40255-2021.pdf

GB/T40255-20216.9电炉或微波炉等其他加热设备。6.10微量移液器：量程0.5L10L、2L20L、20L一200L、100L1000L。7样品7.1采样对象中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)等易感对虾。参见附录B,7.2采样数量、方法和保存运输采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.4一2012附录B的要求。73样品的采集7.3.1对虾仔虾取完整个体；幼虾、成虾和亲虾取肝胰腺：亲虾的非致死性取样可采集粪便。7.3.2分子生物学检测时，仔虾或达到0,5g样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检测。所取样品分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取或暂时保存于一20。8试验步骤8.1DNA的提取8.1.1取30mg50mg组织样品，加入抽提缓冲液500L,充分研磨，37温浴1h。提取过程同时设置阳性对照和阴性对照。8.1.2加人2.5L20mg/mL蛋白酶K,至终浓度100g/mL,混匀后置于50水浴3h,不时旋动，8.1.3将溶液冷却至室温，加人等体积平衡酚，颠倒混合10min,于10000r/min高心3min分高两相。8.1.4水相移至新1.5mL离心管中，加入等体积酚/氣仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混合10mi,于10000r/min离心1min分离两相。8.1.5水相移至一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混合10min,于10000r/min离心1min分离两相。8.1.6水相移至一新1.5mL离心管中，加入100L10mol/L乙酸铵，混匀后，再加入两倍体积预冷无水乙醇(-20)混匀，-20放置2h,10000r/min离心10min,弃上清。8.1.7用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000r/min离心5min,小心弃掉上清，将沉淀于室温晾干。8.1.8加人100L灭菌双蒸水溶解DNA。8.1.9若DNA样品需要保存，可溶解于100LTE缓冲液中并保存于一20。8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒。8.2PCR扩增8.2.1PCR反应体系：按照表1的要求，加入除Taq DNA聚合酶以外的各项试剂，配制成大体积的预混物，分装保存于一20。临用前，加入相应体积的Taq DNA聚合酶，混匀，按1个反应体系/支分装到0.2 mL PCR管中。分别加入各样品的模板DNA(浓度：50ng/L100ng/L)1L,同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。