动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法 实时荧光PCR方法 GBT 21103-2007.pdf

GB/T21103-20075.2.4阳性对照用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照。5.2.5双蒸水。6仪器与设备6.1实时荧光PCR检测系统。6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3电子天平：感量0.01g。6.4离心机：离心力12000g。6.5微量移液器：0.5L10L,10L100L,10L200L,100L1000L。6.6实时荧光PCR反应管。6.7恒温水浴箱。7试样的选取与制备按照GB/T14699,1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。8检验步骤8.1DNA提取称取适量饲料（饲料粒度为100目称取50mg:60目称取100mg:20目称取200mg)于1.5mL离心管中，加入600L800L裂解液，6530min,期间每隔10min振荡混匀：12000r/min离心5min,吸取上清液至一新离心管中，加400L三氯甲烷十异戊醇(24十1)，充分混匀：12000r/min离心5min,吸取上清液至一新离心管中，加0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1h一2h:12000r/min离心10min,弃上清液：70%乙醇洗涤一次，晾干：加入50LTE,溶解沉淀。也可用等效的DNA提取试剂盒提取模板DNA。8.2DNA浓度和纯度的测定取5LDNA溶液加双蒸水稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸光值Azo和A2w。DNA的浓度按式(1)计算：c=AN50/10004444(1）式中：c一DNA浓度，单位为微克每微升(g/L):A一260nm处的吸光值：N一核酸稀释倍数。当Ao/Aa比值在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。8.3实时荧光PCR检测8.3.1反应体系的体积为25L,2哺乳动物源性检测顶混合液加12.5L,哺乳动物源性检测引物混合液和哺乳动物源性检测探针混合液各加1L,样品DNA(1ng/L100ng/L)1L,加双蒸水至25L。8.3.2在各实时荧光PCR反应管中加入上述试剂后，盖紧管，离心5s10s。8.3.3将离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。8.3.4实时荧光PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为：95C10s,1个循环：95C5s,60C30s,40个循环，在每次循环的迟火时收集荧光。少