草鱼出血病诊断规程 GBT 36190-2018.pdf

1CS65.020.30B41B中华人民共和国国家标准GB/T36190-2018草鱼出血病诊断规程Protocol of diagnostic methods for hemorrhagic disease of grass carp2018-05-14发布2018-12-01实施国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T36190-2018RNA:核糖核酸(ribonucleie acid)SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel e-lectrophoresis)TBE:三羟甲基氨基甲烷明酸乙二胺四乙酸缓冲液(Tis-Borate-EDTA)4试剂和材料4.1琼脂糖：电泳级。4.2邻苯二胺：分析纯。4.3AMV逆转录酶：10U/L,一20保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。4.4RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor):一20保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。4.5dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L,-20保存。4.6Taq酶：10U/L,保存温度为一20，同时应避免反复冻融或温度剧烈变化。4.7无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20。4.8DNA分子量标准：DNA Marker2000,4保存，4.9辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠抗体：一20保存。4.10过氧化氢：分析纯。4.11GCRV参考株：GCRV873株(GCRV I型)、GCRV9014株(GCRV型)、GCRV HB1007株(GCRV型)。注：由农业部相关部门指定机构提供。4.12羊抗GCRV免疫球蛋白：-20保存。注：由动物防疫管理部门指定单位提供。4.13鼠抗GCRV单克隆抗体：一20保存。注：由动物防疫管理部门指定单位提供。4.14鱼类细胞系：C0应符合SC/T7016.3的规定。4.15水：GB/T6682中一级水，核酸抽提和RT-PCR须使用无RNA酶的去离子水。4.16鱼类细胞培养液：用含厄尔平衡盐(Earles balanced salts)的M199培养基配制（见附录A中A.1),或其他商品化的细胞培养基，另加10%胎牛血清(FBS)。4.17鱼类细胞维持液：用含厄尔平衡盐(Earles balanced salts)?的M199培养基配制，另加2%胎牛血清(FBS)。4.18细胞消化液：见A.2。4.19AMV逆转录酶缓冲液和Tag酶缓冲液：分别见A.6、A.7。4.20电泳缓冲液：TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液，见A.8)。4.21MgC,:25mmol/L,保存温度为-20，4.22包被稀释液：为0.05mol/L、pH=9.6的碳酸盐缓冲液（见A.11)。4.23封闭液：1%明胶（用包被稀释液配制）。4.24终止液：2mol/L的硫酸。4.25依据GCRV I型中S10片段序列设计引物，扩增S10中的698bp片段（见附录B中B.1):10mol/L正向引物：5-CCCCG-ATCAT-CACCA-CGAT-3;10mol/L反向引物：5-CGCGT-TCGCT-GATGA-AAGG-3。4.26依据GCRV II型的M6片段序列设计引物，扩增M6中的320bp片段（见B.2):10mol/L正向引物：5-AGTTC-TCAAA-GCTGA-GACAG-3:10mol/L反向引物：5-ACGTG-CGATT-GGAAG-AGCTT-3。2