传染性囊病诊断技术 GBT 19167-2003.pdf

GB/T19167-20032.5.2直接免疫荧光法2.5.2.1材料及方法2.5.2.1.1高免血清采用CJ801株毒制各的高免血清，经AGD测定效价为1：128以上，经中和试验测定在2(1：2084)以上。2.5.2.1.2直接荧光抗体的制备采用33%饱和硫酸铵盐析，沉淀免疫球蛋白，经透析并通过Sephadex G50柱去铵离子，用紫外分光光度计测定球蛋白浓度在20mg/mL25mg/mL左右，以异硫氢酸荧光素(FITC)按1%量采用热标记方法标记，再经透析和SephadexG50柱层析，收集荧光抗体，保存于一20C冰箱备用。2.5.2.1.3标本的制备及染色取分离株法氏囊制成冰冻切片或用其组织制成压片。待自然干燥，以4保存的冷丙酮溶液固定10min,0.1mol/LpH7.2减酸盐缓冲液冲洗两次，蒸榴水冲洗一次，风干后用1：81：16荧光稀释液为工作液，滴加在切片上置湿盒中，在37C温箱中静置30，再经磷酸盐缓冲液、蒸馏水冲洗，风干，滴加甘油级冲液封固、镜检。2.5.2.2镜检及判定标准用荧光显微镜检查。采用法氏囊冰冻切片为荧光诊断标本，法氏囊病毒侵害法氏囊后主要表现在淋巴小叶的髓质部。首先在淋巴滤胞胞浆中发出黄绿色荧光颗粒，胞核位于中间为暗色不发光。感染初期常见到“光轮”样结构的淋巴滤胞，感染最严重时由于大量病毒在泡浆中复制发出强荧光的亮斑。皮质不发光。具有上述淋巴图像称为特异性荧光，判为阳性。根据荧光强弱，荧光细胞的数量及荧光结构的清晰度可判为“十十十十、十十十、十十、十”。淋巴小叶结构完整而清晰，又不发荧光者判为阴性。3琼脂凝胶免疫扩散3.1材料准备3.1.1鸡传染性囊病诊断抗原和标准阳性血清。3.1.2琼脂板制备方法见附求A。3.1.3被检血清样品：被检鸡血清应新鲜，分离后56C灭活30min,采血后分离的血清可以当天使用，也可置一20C保存备用。3.2操作程序3.2.1打孔反应孔按画好的七孔图案打孔，将画好的七孔图案放在有琼脂板的平皿下，按照图案在固定位置用不锈钢小管打孔，中心孔径3mm,外周孔径3mm,外周孔与中间孔间距3mm,打孔时切下的琼脂可以吸出也可以用针头挑出。打好后，在酒精灯上适当加热平皿底部，使琼脂与玻璃平皿贴紧，避免由于打孔时导致的琼脂与平皿脱离。3.2.2加样3.2.2.1抗体的定性与定量测定若是做定性试验，不需要稀释血清，只将血清样品直接加入琼脂板孔中：但若要定量测定血清沉淀抗体的滴度，可以在24孔或96孔V形培养板上稀释血清，各孔预先加人50L的PBS,然后倍比稀释血清，最后更换吸头由高稀释度开始加样。3.2.2.2抗原及血清在孔内的添加如图1所示，中央孔7加抗原，1、4孔加阳性血清，2、3、5、6孔加被检血清，各孔加到孔满为止。如果定量检测血清的沉淀抗体，采用中央孔7加抗原，周围1一6孔依次加入各不同稀释度的血清样品。在琼脂板上另做二孔，打法及间距同前，分别加入阳性血清和抗原，设立阳性对照。加盖将平皿置于湿盒或容器中，在37C条件下反应，逐日观察，72h终判。2