SPF鸡 微生物学监测 第2部分：SPF鸡 红细胞凝集抑制试验 GBT 17999.2-2008.pdf

GB/T17999.2-2008SPF鸡微生物学监测第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验1范围GB/T17999的本部分规定了红细胞凝集抑制试验的技术要求。本部分适用于对SPF鸡进行以下病原微生物的血凝抑制抗体检测：禽流感病毒(Avian InfluenzaVirus),传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus),新城疫病毒(Newcastle Disease Virus),禽腺病毒群（减蛋综合征病毒）(Avian Adenovirus Group)，鸡毒支原体(Mycoplasma galliseptic-um),滑液粪支原体(Aycoplasma synoviae)。2原理许多病原微生物具有凝集动物红细胞的能力，这种凝集红细胞的能力能被特异性抗体所抑制，因此可用已知病原微生物检测相应的血凝抑制性抗体。3试剂和器材3.1试剂3.1.1血凝抗原。3.1.2阴性、阳性血清。3.1.3被检血清。3.1.4鸡红细胞。3.1.50.85%氯化钠(NaC)(见附录A)。3.1.6阿氏液（见附录A)。3.2器材3.2.196孔微量血凝板(U形孔或V形孔)。3.2.2微量移液器（量程为25L、50L、100L)或可调微量移液器（量程涵盖25L、50L、100L)及吸头。3.2.3水浴锅。3.2.4离心机与刻度离心管。4操作程序4.1红细胞悬液的制备和抗原血凝效价测定4.1.11%鸡红细胞悬液的制备参见附录B。4.1.2抗原血凝效价测定4.1.2.1于96孔微量血凝板的第1孔第12孔加入生理盐水25L,共作2排。每排的第1孔加入抗原25L,用微量移液器，从第1孔第11孔对抗原作系列倍比稀释：即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次后，吸出25L移至第2孔，再反复吹吸3次后，吸出25L移至第3孔，依此类推，直至第11孔。从第11孔中吸出25L弃去，此孔抗原的最终稀释度为1：2（即111og)。第12孔作为对照孔，GB/T17999.2-20084.1.2.2每孔中加入25L生理盐水，再加入1%鸡红细胞悬液25L。4.1.2.3将血凝板置振荡器上500r/min振荡1min2min。4.1.2.4在室温1825C下静置20min40min,或37C静置15min20min,或4C静置60 min.4.1.2.5抗原血凝效价判定：在反应时间内，对照孔的红细胞全部沉淀时，观察判读血凝结果。对于使用U形孔微量血凝板进行的试验，可根据表1中列举的标准进行判读。表1血凝试验结果判读标准类别孔底所见结果1红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集+2红细胞凝集基本同类别1，但孔底有大图+3红细胞于孔底形成中等大的图，四周有小凝块+7红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块分红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集注：能使红细胞完全凝集(100%凝集，十十十十)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位，注意对照孔应呈现完全不凝集（一），否则此次试脸无效，对于使用V形孔微量血凝板进行的试验，将血凝板倾斜70，观察沉淀于孔底的红细胞是否沿倾斜面向下呈线状流动。以出现全部凝集（红细胞无流动）的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，该效价为1个血凝单位。若血凝效价高于111o时，可继续增加稀释孔数，进行血凝效价测定。血凝试验举例说明见表2，表2微量血凝试验操作、结果判定举例孔号23456789101112滴度(Iog:)167891011对照生理盐水/L252512512512525252525252525倍比稀释的抗原/2525252525252525252525弃去254L生理盐水/L2525252525252525252525251%鸡红细胞/L25252525625252525252525作用温度、时间1825，静置2040min判定举例+血凝价判定为91og。4.2血清的处理和血凝抑制试验4.2.1被检血清样品准备被检血清，包括阳性、阴性血清，置于56C水浴中30min45min,以破坏补体及血凝抑制因子。4.2.2抗原准备进行血凝抑制试验时各种抗原所用血凝单位为4个血凝单位。以4个血凝单位抗原的配制为例：如果某抗原的血凝效价为91og,配制4个血凝单位则进行1：2稀释(2”/22=2)，取生理盐水11.8mL,加入1：10稀释的抗原1.0mL,混合均匀即可。4.2.3抗原血凝效价的重测定4.2.3.1为了确证血凝抑制试验时使用抗原的活性，有必要对已配制的4个血凝单位抗原进行血凝效2GB/T17999.2-2008价的再测定，此项试验常与血凝抑制试验同时进行。4.2.3.2第1孔分别加入50L4个血凝单位抗原。4.2.3.3第2孔第4孔各加生理盐水25L。4.2.3.4将抗原分别作系列倍比稀释至第4孔，从第4孔吸25L弃去。4.2.3.5每孔加1%鸡红细胞悬液25L。4.2.3.6将血凝板置微量振荡器上以500r/min振荡1min2min,4.2.3.7室温1822感作20min40min左右。4.2.3.8观察结果，4、2、1血凝单位孔红细胞出现完全凝集，0.5血凝单位孔红细胞出现50%凝集。若不相符，则应重新标定抗原的血凝单位，同时进行的血凝抑制试验也需重新进行。4.2.4血凝抑制试验4.2.4.1血凝板每排检测一份被检血清，设阳性血清与阴性血清对照。4.2.4.2第1孔第12孔，每孔加人25L生理盐水。4.2.4.3吸取血清25L加入第1孔中，混匀后吸取25L加入第2孔中，依此类推倍比稀释到第11孔，弃去25L,第12孔作为空白对照孔。4.2.4.4第1孔第11孔分别加入25L4个血凝单位抗原。血凝板置微量振荡器上以500r/min振荡1min2min,4.2.4.5每孔加入1%鸡红细胞悬液25L,以500r/min振荡1min2min混匀，置室温(1822C)静置20min40min或4C静置60min,此时对照孔（第12孔）的红细胞已沉淀为一个圆点。4.2.4,6静置完毕，对于使用U形孔微量血凝板进行的试验，根据表1中列举的标准进行判读。对于使用V形微量血凝板进行的试验，将血凝板倾斜T0，凡沉淀于孔底的红细胞沿倾斜面向下呈线状流动。呈现与红细胞对照孔（第12孔）一样者为完全不凝集孔。出现完全不凝集的血清最高稀释度为该被检血清血凝抑制效价。血凝抑制试验举例说明见表3。表3微量血凝抑制试验操作、结果判定举例孔号o滴度(1og)1011对照生理盐水/L252525252525252525252525倍比稀释的被检血清/L2525252525252525252525弃去25 uL4个血凝单位抗原/L25252525252525252525作用温度，时间1825，静置2040min1%鸡红细胞/L25262525252525252525作用温度，时间18一25，静置20-40min判定举例+被检血清血凝抑制价为1：32(2)。5结果判定5.1检查各种对照。阴性血清血凝抑制滴度应1：4(22)，阳性血清血凝抑制滴度与已知滴度不应相差一个滴度以上。红细胞对照无血凝现象。5.2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽腺病毒群(EDS)的血清血凝抑制效价1：16(2)判为阳性；鸡毒支原体、滑液囊支原体的血清血凝抑制效价1：64(2)判为阳性。