纯血马DNA亲子鉴定技术规程 GBT 26612-2011.pdf

GB/T26612-2011纯血马DNA亲子鉴定技术规程1范围本标准规定了纯血马DNA亲子鉴定所用的方法、过程、结果的记录和解读等。本标准适用于纯血马的亲子鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范SN/T1119进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1纯血马Thoroughbred符合国际纯血马登记委员会(International Stud Book Committee,ISBC)规定、在ISBC批准的成员国登记委员会登记了的马匹。3.2微卫星DNA亲子鉴定方法parentage testing with DNA technique以微卫星DNA多态性及孟德尔遗传规律为基础的亲子鉴定方法。4原理根据微卫星DNA的侧翼序列设计引物，对微卫星DNA位点进行扩增，其中包括国际动物遗传协会(International Society of Animal Genetics,ISAG)和ISBC要求的九个微卫星位点。通过凝胶电泳判定个体的基因型。根据孟德尔遗传规律，比对亲代个体和子代个体各微卫星DNA位点的基因型是否相符，从而达到亲子鉴定的目的。5试剂与器材5.1试剂5.1.1乙醇(ethanol),分析纯。5.1.2异丙醇(isopropanol),分析纯。5.1.3氢氧化钠(NaOH),分析纯，5.1.4乙二按四乙酸二钠(EDTA),分析纯。5.1.5氯化钠(NaC1),分析纯。5.1.6十二烷基硫酸钠(SDS),分析纯。5.1.7乙酸钾(CH:COOK),分析纯，5.1.8氯化锂(1iC1),分析纯。1GB/T26612-20115.1.9氯化钾(KC1),分析纯。5.1.10氯化镁(MgC12),分析纯。5.1.1130%(质量分数)丙烯酰胺溶液：将29%丙烯酰胺和1%N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于去离子水，充分搅排溶解并过滤去杂质，避光保存。5.1.12过硫酸铵，分析纯。5.1.13硼酸(boric acid),分析纯。5.1.14乙酸，分析纯。5.1.15甘油，分析纯。5.1.16四硼酸钠，分析纯。5.1.17硝酸银(AgNO3),分析纯。5.1.18甲醛，分析纯。5.1.19溴化乙锭，分析纯。5.1.20 Taq DNA聚合酶。5.1.21溴酚蓝，分析纯。5.1.22盐位(HC1),分析纯。5.1.23三（羟基甲基）氨基甲烷(Tris Base)?,分析纯，5.1.24 Tris-HCI:由Tris Base和HCl组成的缓冲溶液。5.1.25三磷酸脱氧核苷酸混合物(dNTPs):等量的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)的混合物。5.1.26毛囊裂解液：200mmol/L NaOH。5.1.27中和液：200mmol/LHCl,100mmol/L Tris-HCI,pH8.5,5.1.28缓冲液：a)血液裂解缓冲液(Buffer A):100mmol/L Tris-HC(pH7.5),100mmol/L EDTA,100mmol/LNaC1,0.5%(质量分数)SDS:b)蛋白沉淀缓冲液(Buffer B):200mL5mol/L CH,COOK,500mL6mol/L LiCI混匀后使用；c)DNA溶解缓冲液(TE):10mmol/L Tris-HC1,1mmol/1EDTA,pH=8.0:d)电泳解缓冲液5TBE:446mmol/L Tris Base,.445mmol/L Borie Acid,10mmol/L EDTA(pH8.0);c)电泳解缓冲液50XTAE:2mol/L Tris减，1mol/L冰乙酸，0.1mol/L EDTA(pH8.0):D上样缓冲液：30mmo1/L EDTA,36%(体积分数)丙三醇，0.05%（质量/体积分数）澳酚蓝，pH=7.0;g)10PCR级冲液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.0),0.5mol/LKCl,15mmol/L MgCl2。5.1.29琼脂糖（分析纯），5.1.30N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)。5.1.31琼酯糖胶：琼脂糖加入电泳解缓冲液，加热熔解冷却后制成的胶状物，可用于DNA电泳。5.2器材5.2.1全自动DNA分析仪。5.2.2离心机，离心力10000g。5.2.3紫外可见分光光度计。5.2.4移液器，量程0.1L1000L。5.2.5PCR仪，96孔热循环。5.2.6水平电冰槽，长度31cm。2