鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法 GBT 36848-2018.pdf

ICS 65.020.01B16GB中华人民共和国国家标准GB/T36848-2018鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Avocado sunblotch viroid2018-09-17发布2019-04-01实施国家市场监督管理总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法GB/T36848-2018中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址：服务热线：400-168-00102018年9月第一版书号：1550661-61332版权专有侵权必究GB/T36848-2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张永江、郑耘、张京萱、辛言言、向均、卢小雨。GB/T36848-2018鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了鳄梨日斑类病毒逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带鳄梨日斑类病毒的植物及其果实的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3基本信息中文名：鳄梨日斑类病毒学名：Avocado sunblotch viroid缩写：ASBVd分类地位：鳄梨日斑类病毒科(Avsunviroidae)鳄梨日斑类病毒属(Avsunviroid)。鳄梨日斑类病毒的其他信息参见附录A。4方法原理根据ASBVd在寄主植物上的症状进行初步判定；根据其RNA自然状态和变性后的不同结构分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(Return-PolyacrylamideGel Electrophoresis,R-PAGE)检测；根据基因组特征进行 RT-PCR检测，通过电泳条带大小进行结果判定。5仪器设备及设施、用具及试剂5.1仪器设备及设施天平（感量0.001g)、高速冷冻离心机、pH计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离检疫温室、恒温水浴、低温冰箱等。微量移液器(2L、10 L、20L、100 L、200 L、1000 L)、研钵、离心管(1.5 mL、2.0 mL)、花盆、消毒土等。5.2RT-PCR检测试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。具体见附录B。1GB/T36848-20185.3往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。具体见附录C。6样品制备6.1种子类随机抽取100粒种子，将其分为五组，在适宜的发芽温度(2028)下催芽，直至长出第一对真叶。随机抽取20株苗叶片，每株取1g叶片，制备成一个样品。6.2苗木类将鳄梨苗木等繁殖材料种植在隔离温室中，于25生长并观察症状。表现症状的叶片（或花芽）直接取症状部位1g制备成一个样品；无症状植株则5株为一组，混合采集叶片（或花芽）1g制备成一个样品。7检测方法7.1RT-PCR检方法见附录B。7.2往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定方法见附录C。8结果判定如RT-PCR检测结果为阳性，往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定也为阳性，可判定待检样品带有鳄梨日斑类病毒。如RT-PCR检测结果为阴性，则判定待检样品不带有鳄梨日斑类病毒。9样品和档案保存9.1样品保存经检测确定携带鳄梨日斑类病毒的样品干燥后在一80冰箱保存1年。在鳄梨繁殖材料中发现该类病毒的，采集叶片、花芽等类病毒浓度较高的材料干燥处理保存。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档，以便必要时复核。9.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。RT-PCR检测需有电泳结果及测定序列；往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定需有图片。2