鲍疱疹病毒病诊断规程 GBT 37115-2018.pdf

GB/T37115-20187.3样品采集按GB/T18088的规定执行，取鲍含神经组织丰富的组织器官，包括脑神经节、侧足神经节等。8组织病理学检测8.1取样取鲍的神经组织。8.2固定迅速将组织用Davidson氏固定液（见B.1)固定2h以上。根据组织块大小，固定时间可适当调整，或放置过夜，期间按需要更换一次固定液。临床样品也可用10%甲醛固定，长期保存。8.3切片固定好的组织块用水充分洗涤，按下列程序处理：70%乙醇(60min)85%乙醇(60min)95%乙醇(60min)无水乙醇(2次，30 min/次)二甲苯+无水乙醇（体积比1：1）(30min)二甲苯浸泡(2次，30min/次)二甲苯+石蜡（体积比1：1）(15 min)石蜡(15min)两次石蜡包埋切片（根据组织块大小和种类，各步时间作适当调整)。切片厚度不超过6gm。8.4切片处理染色二甲苯(5 min)二甲苯+无水乙醇（体积比1：1）(3 min)无水乙醇(3 min)95%乙醇(3min)85%乙醇(3 min)70%乙醇(3 min)蒸馏水(5 min)苏木精(60 min)伊红(5 min)蒸馏水(5 min)85%乙醇(5 min)95%乙醇(5 min)无水乙醇浸泡(2次，5 min/次)二甲苯+无水乙醇(体积比1：1)(5min)二甲苯浸泡(2次，5min/次)中性树脂封片。8.5结果判定用普通显微镜观察，观察到器官中结缔组织以及神经组织的坏死性病变可初步判定AbHV阳性。9核酸鉴定9.1样品处理样品采取好运送到实验室后，在1.5mL离心管中首先加入25mg100mg组织，加入150LCTAB溶液（见B.2),用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再加CTAB溶液到900L。混匀后置于25作用2h待用。9.2核酸抽提取前处理好的匀浆组织约20mg放入1.5 mL微量离心管中，加800L抽提液I(酚/三氯甲烷/异戊醇)（见B.3),充分混合30s:12000r/min离心5 min,取上层水相；加700L抽提液（三氯甲烷/异戊醇)（见B.4),用力混合30s:12000r/min离心5min,取上层水相；加1.5倍体积-20预冷的无水乙醇，混匀后一20过夜以沉淀核酸。15000r/min离心30min,小心弃上清，立即用滤纸吸干（应尽量充分吸干)，37干燥20min或抽真空干燥；最后加10L水溶解后，作为模板待用。组织核酸提取也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒，按照说明书进行操作。3