免疫细胞功能检测技术概述.pptx

免疫细胞功能检测技术免疫细胞功能检测技术第一页，共四十三页。一一 淋巴细胞的功能检测淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反响；体外实验主要包括淋巴或有丝分裂原的应答反响；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反响、细胞细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反响、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 第二页，共四十三页。淋巴细胞淋巴细胞T T细胞负责细胞免疫功能细胞负责细胞免疫功能B B细胞执行体液免疫功能细胞执行体液免疫功能NKNK细胞非特异性免疫作用细胞非特异性免疫作用 第三页，共四十三页。一、一、T细胞功能的检测细胞功能的检测T T细胞增殖试验细胞增殖试验T T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验体内试验体内试验第四页，共四十三页。一一T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验1.1.原理：原理：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松第五页，共四十三页。未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小(直径直径m)m)12122020121216166 68 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 14 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无第六页，共四十三页。2.2.淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：非特异性刺激物：PHA -TPHA -T细胞细胞 ConA-TConA-T细胞细胞 PWM-TPWM-T、B B细胞细胞 LPS -BLPS -B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物：异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原 第七页，共四十三页。3.3.检测方法检测方法 形态法：刺激物 淋巴细胞4-6天 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞54h DNA合成期 +3HTdR掺入 收集细胞 检测射线 测定细胞内的测定细胞内的3H3HTdRTdR第八页，共四十三页。1 1形态学检查法形态学检查法第九页，共四十三页。方法学评价：方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。重复性和准确性较差。第十页，共四十三页。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性2 23H-TdR3H-TdR掺入法掺入法第十一页，共四十三页。优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。存在放射性核素污染问题。第十二页，共四十三页。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(3)MTT(3)MTT 比色法比色法第十三页，共四十三页。(二二)T)T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺细胞经各种丝裂原或抗原刺激后激后,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映生物学活性或基因表达水平，以反映T T细胞功能。细胞功能。第十四页，共四十三页。三三T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验1.1.原理：原理：靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞第十五页，共四十三页。形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞肿瘤细胞 计数残留计数残留肿瘤细胞肿瘤细胞2.2.方法方法意义：意义：肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 第十六页，共四十三页。图图15-2 T15-2 T细细胞胞细细胞毒胞毒试验试验示意示意图图第十七页，共四十三页。靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时5151CrCr释放法释放法第十八页，共四十三页。(四四)体内试验体内试验特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验PHAPHA皮肤试验皮肤试验 第十九页，共四十三页。二、二、B细胞功能检测细胞功能检测B B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验溶血空斑试验溶血空斑试验B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测体内试验体内试验第二十页，共四十三页。(一一)B)B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验抗抗IgMIgM细菌脂多糖细菌脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞增殖细胞增殖形态学形态学3 3H HTdRTdR掺入法掺入法第二十一页，共四十三页。(二二)溶血空斑试验溶血空斑试验1.1.原理：原理：第二十二页，共四十三页。2.2.方法学：方法学：经典溶血空斑形成试验经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验被动溶血空斑试验 第二十三页，共四十三页。3 3临床应用与评价临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能物和手术等因素对体液免疫功能的影响的影响评价免疫治疗或免疫重建后机评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。体产生抗体的能力。第二十四页，共四十三页。(三三)B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法ELISPOTELISPOT1.原理：原理：第二十五页，共四十三页。2 2应用与方法学评价：应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。可检测抗体分泌量。优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。第二十六页，共四十三页。(四四)体内试验体内试验体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，别离血清，周分别采血，别离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内检者体内B B细胞的功能。细胞的功能。第二十七页，共四十三页。染色计数染色计数离心取上清离心取上清测测LDHLDH或或AKPAKP离心取沉淀离心取沉淀测活细胞荧光测活细胞荧光测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值形态法形态法酶释法酶释法荧光法荧光法同位素法同位素法化学发光法化学发光法三、三、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞:K562细胞株第二十八页，共四十三页。二二 吞噬细胞功能检测技术吞噬细胞功能检测技术 按其形态大小分为两类：按其形态大小分为两类：大吞噬细胞大吞噬细胞单核单核-吞噬细胞系统吞噬细胞系统小吞噬细胞小吞噬细胞中性粒细胞中性粒细胞第二十九页，共四十三页。一、中性粒细胞功能的检测一、中性粒细胞功能的检测 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测 吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测第三十页，共四十三页。(一一)细胞运动功能细胞运动功能趋化功能检测趋化功能检测1.1.原理：原理：第三十一页，共四十三页。2.2.方法：方法：琼脂糖平板法琼脂糖平板法 滤膜渗透法滤膜渗透法Boyden Boyden 小室法小室法第三十二页，共四十三页。(二二)吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 1 1显微镜检查法：显微镜检查法：第三十三页，共四十三页。2.2.溶菌法溶菌法第三十四页，共四十三页。NBTNBT复原试验复原试验 原理：原理：N-N-C +H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基淡黄色四氮唑基淡黄色甲臜紫黑色甲臜紫黑色3 3NBTNBT复原试验复原试验 第三十五页，共四十三页。中性粒细胞中性粒细胞NBTNBT甲甲臜臜颗粒沉积于胞质中颗粒沉积于胞质中第三十六页，共四十三页。二、巨噬细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测(一一)炭粒廓清试验炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬去除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬去除90%90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬去除炭粒，脾巨噬细胞约吞噬去除10%10%炭粒。据炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。度，判断巨噬细胞的功能。第三十七页，共四十三页。(二二)吞噬功能检测吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。第三十八页，共四十三页。(三三)巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定1 1酸性磷酸酶的测定酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2非特异性酯酶的测定非特异性酯酶的测定 常用常用-萘醋酸法萘醋酸法第三十九页，共四十三页。(四四)细胞毒作用测定细胞毒作用测定 用用IFN-IFN-激活小鼠巨噬细胞，观察其对激活小鼠巨噬细胞，观察其对125125I-I-UdRUdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀伤的杀伤活性。活性。第四十页，共四十三页。(五五)巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经取已经3737预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaCl2CaCl2混合混合液，参加经粘附有单层巨噬细胞的试管中，液，参加经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置移置3737，即时记录血浆凝固时间。，即时记录血浆凝固时间。第四十一页，共四十三页。Thanks！第四十二页，共四十三页。内容总结免疫细胞功能检测技术。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。T细胞负责细胞免疫功能。未转化和转化淋巴细胞的形态特征。PWM-T、B细胞。LPS -B细胞。肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力。可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量。体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。常用靶细胞:K562细胞株。二 吞噬细胞功能检测技术。Thanks第四十三页，共四十三页。