2022年医学专题—第三章细胞破碎..ppt

第三章第三章细细 胞胞 破破 碎碎1第一页，共七十四页。生物分离过程生物分离过程(guchng)(guchng)的一般的一般流程流程本章(bn zhn)内容2第二页，共七十四页。常见(chn jin)的细胞壁结构细胞破碎(p su)技术包涵体的纯化(chn hu)方法本章的主要内容3第三页，共七十四页。概述概述(i sh)不同类型的细胞分泌目标产物的类型：不同类型的细胞分泌目标产物的类型：n动物细胞多分泌到细胞外培养液动物细胞多分泌到细胞外培养液n植物细胞多为胞内产物植物细胞多为胞内产物n微生物（细菌微生物（细菌/酵母酵母/真菌）胞内、胞外真菌）胞内、胞外 对于对于(duy)胞内产物需要收集菌体或细胞胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。进行破碎。4第四页，共七十四页。概述概述(i sh)(大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。氨基酸等目标产物存在于发酵液中。(有些目标产物存在于生物体中。有些目标产物存在于生物体中。l尤尤其其是是由由基基因因工工程程菌菌产产生生(chnshng)的的大大多多数数蛋白质是在细胞内沉积。蛋白质是在细胞内沉积。l脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。5第五页，共七十四页。概概 述述细胞破碎（细胞破碎（cell rupturecell rupture）技术是指利用外力破坏）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。型生化物质（产品）的基础。为了为了(wi le)(wi le)研究细胞破碎，提高其破碎率，有必研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。6第六页，共七十四页。3.1 3.1 细胞壁结构细胞壁结构(jigu)(jigu)对破碎的影响对破碎的影响Z微生物细胞和植物微生物细胞和植物(zhw)(zhw)细胞外层均为细胞壁，细胞壁细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。Z不不同同细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成不不完完全全相相同同，故故细细胞胞壁壁的的机机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。7第七页，共七十四页。细菌细菌(xjn)(xjn)细胞壁结细胞壁结构构Z几几乎乎所所有有细细菌菌(xjn)(xjn)的的细细胞胞壁壁都都是是由由肽肽聚聚糖糖组组成成，它它是是难难溶溶性性的的聚糖链；聚糖链；Z相相邻邻聚聚糖糖链链上上的的短短肽肽又又交交叉叉相相联联，构构成成了了细细胞胞壁壁的的三三维维网网状状结结构构，包围在细胞周围；包围在细胞周围；Z使细胞具有一定的形状和强度。使细胞具有一定的形状和强度。8第八页，共七十四页。细菌细菌(xjn)(xjn)细胞壁细胞壁结构结构u破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。的肽键的数量和其交联的程度。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。不同。u革革兰兰氏氏阴阴性性(ynxng)(ynxng)菌菌典典型型的的生生物物是是大大肠肠杆杆菌菌，通通过过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。这种细胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称药物名称宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素人生长激素大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病-干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等治疗毛状细胞白血病等9第九页，共七十四页。u最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成，它它构构成成(guchng)(guchng)了了细细胞胞壁壁的的刚刚性性骨骨架架，使使细细胞胞具具有有一一定定的的形形状，状，u上面的是一层糖蛋白，上面的是一层糖蛋白，u最最外外层层是是甘甘露露聚聚糖糖，由由1,6-1,6-磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接成成网网状状。在在该该层层的的内内部，有甘露聚糖部，有甘露聚糖-酶的复合物。酶的复合物。u破破碎碎酵酵母母细细胞胞壁壁的的阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结结构构交交联联的的紧紧密密程程度度和和它它的厚度。的厚度。10第十页，共七十四页。真菌真菌(zhnjn)(zhnjn)的细胞的细胞壁壁l真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。较少量的蛋白质和脂类。l不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成(guchng)，少数含纤维素。，少数含纤维素。l与与酵酵母母和和细细菌菌的的细细胞胞壁壁一一样样，真真菌菌细细胞胞壁壁的的强强度度和和聚聚合合物物的的网网状状结结构构有有关关，不不仅仅如如此此，它它还还含含有有几几丁丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。11第十一页，共七十四页。l红红面面包包霉霉菌菌细细胞胞壁壁具具有有同同心心圆圆层层状状结结构主要存在三种构主要存在三种(sn zhn(sn zhn)聚合物聚合物l最最外外层层(a)(a)是是-和和-葡葡聚聚糖糖的的混混合物，合物，l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质，l最内层最内层(d)(d)主要是几丁质。主要是几丁质。红面包霉菌红面包霉菌(mjn)细胞壁的结构示意细胞壁的结构示意图图12第十二页，共七十四页。微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖(5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成细胞壁的组成(z chn)和结构和结构微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖(5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成细胞壁的组成(z chn)和结构和结构13第十三页，共七十四页。植物植物(zhw)(zhw)细胞壁的结构细胞壁的结构l对对于于已已生生长长结结束束的的植植物物细细胞胞壁壁可可分分为为初初生生壁壁和和次次生生壁壁两两部分。部分。l初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1 13m3m），），富有弹性。富有弹性。l由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链素和果胶类物质。纤维素是长链D-D-葡聚糖，许多这样的葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。长链形成微纤丝。l它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械(jxi)(jxi)强度主要强度主要来自于微纤丝。来自于微纤丝。14第十四页，共七十四页。植物植物(zhw)(zhw)次生细胞壁次生细胞壁 某某些些植植物物细细胞胞，当当生生长长停停止止后后，在在细细胞胞质质和和初初生生细细胞胞壁壁之之间间形形成成了了次次生生细细胞胞壁壁。次次生生壁壁一一般般(ybn)(ybn)较较厚厚(4m(4m以上以上)，常有三层组成。，常有三层组成。n在在次次生生壁壁中中，纤纤维维素素和和半半纤纤维维素素含含量量比比初初生生壁壁增增加加很很多多，纤纤维维素素的的微微纤纤丝丝排排列列得得更更紧紧密密和和有有规规则则，而而且且存存在在木木质质素素的沉积。的沉积。因因此此次次生生壁壁的的形形成成提提高高了了细细胞胞壁壁的的坚坚硬硬性性，使使植物细胞具有很高的机械强度。植物细胞具有很高的机械强度。15第十五页，共七十四页。研研 磨磨3.2 3.2 细胞破碎细胞破碎(p su)(p su)技术技术16第十六页，共七十四页。机械机械(jxi)破碎破碎捣碎(do su)法研磨法匀浆法超声法 物理物理(wl)破碎破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎受到破坏，而达到细胞破碎细细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理17第十七页，共七十四页。一机械(jxi)法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆高压匀浆(yn jin)(yn jin)破碎法破碎法（homogenizationhomogenization）高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication）18第十八页，共七十四页。采用高压采用高压(goy)匀浆器（由高压匀浆器（由高压(goy)泵和匀浆阀组成）。泵和匀浆阀组成）。1.高压高压(goy)匀浆法匀浆法（High-pressure homogenization）细胞悬浮液自高压室针形细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口被迫改变方向从出口(ch ku)管流出。细胞在这一管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。骤降，造成细胞破碎。19第十