2022年医学专题—电泳技术-昆明医科大学.ppt

n电泳技术电泳技术n(Electrophoresis TechnologyElectrophoresis Technology)钟树荣（钟树荣（PhDPhD，副教授），副教授）昆明昆明(kn mn(kn mn)医科大学法医学院医科大学法医学院第一页，共三十八页。一、电泳一、电泳(din yn)的的概念概念 电电泳泳（electrophoresis）是是指指在在电电解解质质溶溶液液中中，带带电电颗颗粒粒在在外外加加电电场场的的作作用用下下，以以不不同同的的速速度度向向着着与与其其电电荷荷相相反反的的电电极极移移动的现象。动的现象。许许多多重重要要的的生生物物分分子子，如如氨氨基基酸酸、多多肽肽、蛋蛋白白质质、核核苷苷酸酸、核核酸酸等等都都具具有有可可电电离离基基团团，它它们们在在某某个个特特定定的的pH值值下下可可以以带带正正电电荷荷或或负负电电荷荷。利利用用(lyng)(lyng)电电泳泳现现象象对对某某些些化化学学或或生生物物物物质质进进行行分离、分析分离、分析或提纯或提纯的方法和技术叫的方法和技术叫电泳技术电泳技术。第二页，共三十八页。COO-COO-COOH +H+H+Pr Pr Pr +OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PH4.0时，带净的负电荷。时，带净的负电荷。第四页，共三十八页。2、带电颗粒在电场作用下所受的力：带电颗粒在电场作用下所受的力：(Charged particles under the action of electric field force)(Charged particles under the action of electric field force)(Charged particles under the action of electric field force)(Charged particles under the action of electric field force)电场力电场力 F=qE 阻力阻力(zl)(zl)Ff=f q 带电带电(di din)颗粒颗粒所带的有效电荷；所带的有效电荷；E 电场强度；电场强度；带电颗粒带电颗粒在电场中的迁移速度；在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数平动摩擦系数 第五页，共三十八页。F=FfqE=f 对于一个球形对于一个球形带电带电(di din)颗粒颗粒，服从，服从Stoke定律，即：定律，即：f=6 r 6 r r r 为为带电颗粒带电颗粒的表观液态动力学半径，的表观液态动力学半径，为介质粘滞系数。为介质粘滞系数。当电泳达到平衡时，带电颗粒当电泳达到平衡时，带电颗粒(kl)匀速运动匀速运动:(When electrophoresis balance,electrically charged particles in uniform motion)(When electrophoresis balance,electrically charged particles in uniform motion)=qE 6 r 6 r =qE f 带电带电(di din)颗粒在电场中的颗粒在电场中的差速迁移差速迁移是电泳分离的基础。是电泳分离的基础。第六页，共三十八页。3.影响影响(yngxing)电泳速度的因素：电泳速度的因素：(The influencing factors of electrophoresis rate)(The influencing factors of electrophoresis rate)n样品本身：带电量，分子大小，形状样品本身：带电量，分子大小，形状n电场强度：电场强度：n缓冲液：成分，缓冲液：成分，pH，离子强度，离子强度n支持介质的筛孔大小支持介质的筛孔大小：n支持介质：电渗作用支持介质：电渗作用(zuyng)，吸附作用，吸附作用(zuyng)n电渗电渗=qE f=qE 6 r 6 r 第七页，共三十八页。三三、电电泳泳装装置置Electrophoresis apparatus第八页，共三十八页。电源电源电源电源(dinyun)(dinyun)(power(power supply)supply)水平式电泳槽水平式电泳槽水平式电泳槽水平式电泳槽(Horizontal electrophoresis tank(Horizontal electrophoresis tank)垂直垂直垂直垂直(chuzh)(chuzh)式电泳槽式电泳槽式电泳槽式电泳槽(Vertical electrophoresis tank)(Vertical electrophoresis tank)第九页，共三十八页。1.1.按支持介质种类不同分为：按支持介质种类不同分为：惰性介质惰性介质(Inert medium)(Inert medium)：起支持作用，减少起支持作用，减少(jinsho)对流，介质对流，介质本身不参与电泳分离本身不参与电泳分离 纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、硅胶电泳、氢氧化铝电泳纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、硅胶电泳、氢氧化铝电泳凝胶介质凝胶介质(The gel medium)(The gel medium)：起支持作用，减少对流，介质本身参起支持作用，减少对流，介质本身参与电泳分离与电泳分离琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳2.按支持介质形状不同分为按支持介质形状不同分为:薄层电泳薄层电泳、板电泳板电泳、柱电泳柱电泳 四、电泳四、电泳(din yn)(din yn)的分类的分类(The classification of electrophoresis)(The classification of electrophoresis)第十页，共三十八页。3.按电泳槽方向不同分为：按电泳槽方向不同分为：水平电泳、垂直电泳水平电泳、垂直电泳4.按用途不同分为：按用途不同分为：分析电泳、分析电泳、制备电泳制备电泳5.按所用按所用(su yn)电压不同分为：电压不同分为：低压电泳（低压电泳（100V500V）、高压电泳（）、高压电泳（1000V5000V）6.按按分离原理分离原理不同分为：不同分为：移动界面电泳（移动界面电泳（自由界面电泳）、区带电泳、等速电泳、自由界面电泳）、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳等电聚焦电泳、免疫电泳 第十一页，共三十八页。7.按样品按样品(yngpn)(yngpn)是否经过还原剂处理分为：是否经过还原剂处理分为：还原电泳、非还原电泳还原电泳、非还原电泳8.按凝胶介质中是否加入变性剂分为：按凝胶介质中是否加入变性剂分为：变性电泳、非变性电泳变性电泳、非变性电泳9.按电泳系统的均一性分为：按电泳系统的均一性分为：连续电泳、不连续电泳连续电泳、不连续电泳10.按样品被分离时凝胶介质的按样品被分离时凝胶介质的pHpH不同分为：不同分为：酸性电泳酸性电泳（pH=4.3）、碱性电泳（、碱性电泳（pH=8.8）第十二页，共三十八页。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophorsis of DNA)第十三页，共三十八页。一、琼脂糖凝胶电泳的特点一、琼脂糖凝胶电泳的特点(tdin)(The characteristics of the agarose gel electrophoresis)(The characteristics of the agarose gel electrophoresis)琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要(zhyo)(zhyo)是由是由D D半乳糖和半乳糖和3,63,6脱水脱水L L半乳糖连接而成的一种线性多糖。将琼脂糖悬浮于缓冲液，加热溶半乳糖连接而成的一种线性多糖。将琼脂糖悬浮于缓冲液，加热溶解，冷却后即成琼脂糖凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔径解，冷却后即成琼脂糖凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度的大小决定于琼脂糖的浓度。nDNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。nDNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，所带净电荷的多少不同的分子量大小及构型不同，所带净电荷的多少不同,电泳时的泳动电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。率就不同，从而分出不同的区带。第十四页，共三十八页。n分子筛效应（分子筛效应（Molecular sieve effect）：）：分子量或分子大小和形状不分子量或分子大小和形状不同的带电同的带电(di din)(di din)颗粒通过一定孔径的凝胶时，因受阻滞的程度不颗粒通过一定孔径的凝胶时，因受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。移动快；分子量大，阻力大，移动慢。n电荷效应（电荷效应（Charge effect）：）：带电颗粒由于所带带电颗粒由于所带电荷量不同，而在电电荷量不同，而在电泳中泳中表现出不同的迁移率，这就是电荷效应。表现出不同的迁移率，这就是电荷效应。第十五页，共三十八页。第十六页，共三十八页。EBEB显带（显带（EB banding）电泳电泳(din(din ynyn)后后EBEB染色染色EBEB加入加入(jir)(jir)凝胶凝胶中电泳中电泳经经EBEB染色后，电泳染色后，电泳(din yn(din yn)结果在波结果在波长为长为254 nm254 nm的紫外灯下观察。的紫外灯下观察。注意注意 在分子量相当的情况下，在分子量相当的情况下，DNA的电泳迁的电泳迁移率依次为：移率依次为：超螺旋环状超螺旋环状DNA线状线状DNA缺口环状缺口环状DNA第十七页，共三十八页。琼脂糖凝胶电泳由于其所分级分离的生物大分琼脂糖凝胶电泳由于其所分级分离的生物大分子比聚丙烯酰胺凝胶电泳大，因此适合于分离核酸子比聚丙烯酰胺凝胶电泳大，因此适合于分离核酸(h(h sun)sun)（DNADNA和和RNARNA）和蛋白。）和蛋白。三、电泳三、电泳(din yn(din yn)的应用的应用(Application of electrophoresis)(Application of electrophoresis)(Application of electrophoresis)(Application of electrophoresis)第十八页，共三十八页。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophorsis,PAGE)第十九页，共三十八页。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称简称Acr)Acr)和交联剂和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(简称简称Bis)Bis)在加速剂在加速剂N N，N N，N N，N N-四甲四甲基乙二胺基乙二胺(简称简称TEMED)TEMED)和催化剂过硫酸铵和催化剂过硫酸铵(简称简称AP)AP)或核或核黄素黄素(V(VB2B2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。该的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔径的大小凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔径的大小(dxio)(dxio)主要决定主要决定于丙烯酰胺的浓度于丙烯酰胺的浓度。一、聚丙烯酰胺凝胶的特点一、聚丙烯酰胺凝胶的特点(tdin)(Poly propylene ethylene amines gel characteristics)化学化学(huxu)聚合聚合光聚合光聚合 第二十页，共三十八页。聚丙烯酰胺凝胶具有如下聚丙烯酰胺凝胶具有如下优点优点(the advantages of poly(the advantages of poly propylene ethylene am