2022年医学专题—流式细胞术简介.ppt

流式细胞术原理流式细胞术原理/用途用途(yngt)(yngt)/制样制样要求要求张波（药理(yol)室）15009931220 bozhang_第一页，共三十九页。流式细胞仪是什么(shn me)仪器，什么(shn me)时候会用到？第二页，共三十九页。2009年1月20日1月23日2月2日第三页，共三十九页。第四页，共三十九页。第五页，共三十九页。流式细胞术流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,简称简称FCM）是一种可）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征(tzhng)，并加以定量并加以定量第六页，共三十九页。BD FACSCalibur第七页，共三十九页。第八页，共三十九页。流式细胞(xbo)仪可检测到的细胞(xbo)参数非荧光非荧光(ynggung)信号信号颗粒颗粒(kl)度度细胞大小细胞大小前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性复杂性第九页，共三十九页。血液血液(xuy)涂涂片片第十页，共三十九页。外周全外周全(zhuqun)(zhuqun)血细胞散射光双参数点图血细胞散射光双参数点图第十一页，共三十九页。Review QuestionDead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells.Which of the populations on this plot would you expect to be dead?第十二页，共三十九页。第十三页，共三十九页。流式细胞(xbo)仪可检测到的细胞(xbo)参数荧光荧光(ynggung)信号信号第十四页，共三十九页。图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡(dio wn)和坏死第十五页，共三十九页。Two-Color Cell AnalysisWhich of the three populations has the most Ab A binding sites?Ab AAb B第十六页，共三十九页。样本(yngbn)处理第十七页，共三十九页。细胞(xbo)悬液的制备细胞悬液：细胞悬液：分离分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差胞特定群体丢失，并可能引入某些误差直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小样本用血量小灌洗液、体腔积液灌洗液、体腔积液培养细胞、细胞系培养细胞、细胞系实体组织：实体组织：病理组织：新鲜样本病理组织：新鲜样本/石蜡石蜡(sh l)包埋样本包埋样本针吸组织：新鲜样本针吸组织：新鲜样本鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质（鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质（.22滤膜）滤膜）第十八页，共三十九页。植物(zhw)样本的制作第十九页，共三十九页。第二十页，共三十九页。步骤一：选择合适(hsh)的荧光染料必须被流式细胞仪上所配备激光器所激发激发光谱在仪器上滤光片能够接受范围内荧光(ynggung)素光谱的重叠应当尽量减少第二十一页，共三十九页。OpticsLaserFluorochromeDetector ParameterFilterFITCFITCGFPGFPFL1FL1530/30530/30PEPEPIPIFL2FL2585/42585/42PerCPPerCPPerCP-CY5.5PerCP-CY5.5FL3FL3670LP670LPAPCAPCFL4FL4661/16661/16488 nm488 nm635 nm635 nm第二十二页，共三十九页。步骤(bzhu)二：染色体积(tj)温度孵育时间对照第二十三页，共三十九页。步骤三：数据收集(shuj)和分析画图寻找目标细胞调整仪器设置到合适的状态(zhungti)我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？第二十四页，共三十九页。散点图 密度(md)图二维等高图直方图图 报告(bogo)中常见的几种流式细胞图第二十五页，共三十九页。仪器仪器(yq)设置调节设置调节1.用未染色细胞用未染色细胞2.调整调整(tiozhng)仪器仪器PMT电压电压第二十六页，共三十九页。第二十七页，共三十九页。开机(ki j)需准备试剂建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备(zhnbi)下列样品（1）Negative Control（不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1 单染）（3）CD19-PE（FL2 单染）（4）CD3-FITC/CD19-PE（FL1/FL2 双染）。第二十八页，共三十九页。2.用单染色用单染色(rns)的细胞调节仪器补偿的细胞调节仪器补偿第二十九页，共三十九页。关于(guny)同型对照例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE那么需要准备(zhnbi)的是阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE单阳性对照：FITC:细胞加上Ab A FITC,IgG1 PE PE:细胞加上Ab B PE,IgG1 FITC第三十页，共三十九页。第三十一页，共三十九页。第三十二页，共三十九页。数据分析数据分析设门设定阴性与阳性群体(qnt)的界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数第三十三页，共三十九页。第三十四页，共三十九页。第三十五页，共三十九页。第三十六页，共三十九页。第三十七页，共三十九页。第三十八页，共三十九页。内容(nirng)总结流式细胞术原理/用途/制样要求。流式细胞术原理/用途/制样要求。流式细胞仪是什么仪器，什么时候会用到。2月2日。研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等。侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性。分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差。直接(zhji)使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小。确定阳性与阴性细胞群体第三十九页，共三十九页。