2022年医学专题—二细菌的生长繁殖消毒与灭菌.ppt

细菌感染的检测(jin c),第一页，共四十七页。,实验二 细菌的生长繁殖(fnzh)、消毒与灭菌,一、讨论：1、消毒灭菌的方法、实验室生物安全2、细菌的人工培养(piyng)：培养(piyng)基、细菌培养(piyng)技术、细菌生长现象二、示教：1、消毒灭菌的常用方法2、药敏实验3、培养基制备、种类、用途4、细菌生长现象观察三、操作：细菌的接种（液体、半固体、固体培养基）,第二页，共四十七页。,(一）消毒灭菌方法、实验室生物(shngw)安全,1.常用术语消毒(disinfection)：利用理化因素杀死物体或环境中病原(bngyun)微生物的措施。并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原(bngyun)微生物灭菌(sterilization)：利用理化因素杀死物体上所有微生物的过程，包括芽胞。无菌操作（aseptic technique)：防止细菌进入人体或其他物品的操作技术。,第三页，共四十七页。,（2）常用(chn yn)方法,物理消毒(xio d)灭菌法：热力灭菌法：干热灭菌法、湿热灭菌法 辐射杀菌法：电离辐射-X、射线 非电离辐射-紫外线、日光、微波 滤过除菌法：滤过除菌法 干燥低温抑菌法：抑菌和灭菌化学消毒灭菌法：生物消毒灭菌法,第四页，共四十七页。,热力(rl)灭菌法,干热灭菌(mi jn)焚烧、烧灼、红外线干烤（160170/2h）,第五页，共四十七页。,热力(rl)灭菌法,湿热灭菌巴氏消毒法：6230min 或72 30sec煮沸法 30min流动(lidng)蒸气消毒法间歇蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法：121,1.05Kg/cm2(15个大气压),20min,第六页，共四十七页。,辐射(fsh)杀菌法,电离辐射：X、射线原理:通过产生OH、O2等活性游离基进行杀菌(sh jn)；通过破坏DNA的结构导致菌体死亡非电离辐射：紫外线、微波、超声波、日光,第七页，共四十七页。,辐射(fsh)杀菌法：非电离辐射,.紫外线：200 300nm日光(最佳：265266nm)原理：导致DNA分子构型改变DNA复制出现差错用途：只用于空气和物品表面(biomin)的消毒（注意防护）.微波：细菌体内的蛋白质、核酸等分子在微波场下高速旋转、振动，细菌蛋白质凝固、核酸变性而死亡。常用于对非金属器械的消毒，优点是无污染而且迅速。.超声波是指频率大于20kHz的声波，其频率高，波长短，定向性好，穿透力强。原理：空化作用用途：液体或可放置液体中不影响其性能的物品,第八页，共四十七页。,滤过(l u)除菌法,贝克菲滤器 蔡氏滤器 玻璃滤器 膜滤器孔径 0.22um-0.45um除菌空气过滤器:无菌棉花、活性炭及细玻璃纤维等可对空气进行(jnxng)过滤除菌,第九页，共四十七页。,2、化学(huxu)消毒灭菌法,常用消毒剂(disinfectants)的杀菌机制使菌体蛋白变性或凝固干扰微生物酶系统和影响其代谢(dixi)损伤细胞壁、细胞膜,环氧乙烷消毒(xio d)设备,第十页，共四十七页。,医学上常用消毒剂类型作用机制(jzh)及种类,第十一页，共四十七页。,化学(huxu)消毒灭菌法,第十二页，共四十七页。,医疗器械物品的消毒(xio d)灭菌,高危器械物品 需进入无菌组织的物品。所有这些物品都应该灭菌。中危器械物品 不进入无菌组织但接触黏膜的器械。采用消毒(xio d)即可。低危器械物品 只接触未损伤皮肤但不进入无菌组织和不接触黏膜的物品。一般用后清洗、消毒即可。快速周转的医疗器械,第十三页，共四十七页。,室内空气消毒(xio d)灭菌,a.物理消毒法 紫外线照射（1.5W/m3，1h）最常用；滤过除菌：空气通过孔径小于0.2 m的高效过滤装置以除去细菌和带菌尘埃(chn i)b化学消毒法 包括化学消毒剂喷雾和熏蒸过氧乙酸喷雾、熏蒸；过氧化氢喷雾；二氧化氯溶液喷洒；中草药点燃烟熏,第十四页，共四十七页。,手和皮肤(p f)的消毒,用肥皂(fizo)和流动水经常并正确洗手病原微生物污染时应用消毒剂消毒,第十五页，共四十七页。,消毒灭菌(mi jn)的方法,热力(rl)灭菌法,辐射(fsh)杀菌法,滤过除菌法,干燥与低温抑菌法,干热灭菌法,湿热灭菌法,物理消毒灭菌法,化学消毒灭菌法,高效消毒剂,中效消毒剂,低效消毒剂,第十六页，共四十七页。,3、实验室生物(shngw)安全,生物安全（biosafety）是生物技术安全的简称狭义的指现代生物技术的研究、开发、应用及转基因生物可能对生物多样性、生态环境和人类健康产生潜在的危害。广义的指与生物有关的各种因素 对社会、经济、人类健康及生态(shngti)环境所产生的危害或潜在风险。,第十七页，共四十七页。,（1）生物(shngw)安全的内容,转基因生物、外来入侵(rqn)物种、环境污染病原微生物（感染性疾病、人畜共患疾病、动物疾病、食源性疾病、医院感染）实验室泄漏：生物武器、生物恐怖遗传资源保护合成生物技术转基因及其它新型生物技术,第十八页，共四十七页。,事故引发(yn f)的生物危害,是由进行病原体研究、教学、诊断、治疗、生物制品研发和生产等机构的事故导致病原体泄漏，引发了传染病暴发的生物灾害。这类生物灾害往往影响较大，危害范围小，造成局部灾害大，持续短1979年，苏联国防微生物与病毒研究所炭疽芽孢(y bo)干粉制剂车间的加压系统爆炸，约10公斤芽孢(y bo)粉剂泄漏，造成斯维尔德洛夫斯克城数百人伤亡。2003年9月新加坡国立卫生研究院BSL3实验室发生研究人员感染SRAS病毒的事故。2003年12月我国台湾省一实验室也发生了研究人员感染SRAS病毒的事故，2004年4月我国国家CDC的专业实验室发生了SARS的实验室人员感染。,第十九页，共四十七页。,（2）如何实现(shxin)实验室生物安全？,加强管理，规范行为，消除隐患，确保安全 如何管？依法、规范管理 管那些？病原微生物、实验室设立、风险评估、实验活动(hu dng)、实验 装备、废弃物、人员,第二十页，共四十七页。,病原(bngyun)微生物分类管理,第二十一页，共四十七页。,病原(bngyun)微生物实验室的分级管理,第二十二页，共四十七页。,（二）细菌的人工(rngng)培养：,培养基的概念、种类(zhngli)、用途细菌培养技术细菌生长现象,第二十三页，共四十七页。,1.培养基的概念(ginin)、种类、用途、制备,培养基（culture medium):是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合(hnh)营养物制品。基础培养基 增菌培养基 选择培养基 鉴别培养基 厌氧培养基 根据物理性状：液体、固态、半固体,根据(gnj)用途,第二十四页，共四十七页。,牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g氯化氯化钠（NaCL）5.0g磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mL混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌(mi jn)15min，冷却至45倾注灭菌(mi jn)平板。,普通(ptng)琼脂平板制备,第二十五页，共四十七页。,2.细菌的培养(piyng)方法,分离培养：划线接种在固体培养基的表面(biomin)，因划线的分散作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面(biomin)上散开。纯培养：挑取一个菌落，移种到另一培养基中，可生长出来的大量的纯种细菌。发酵培养：在适宜的条件下，发酵罐中大量培养微生物（细菌、真菌等）细胞和生产代谢产物的工艺过程。,第二十六页，共四十七页。,分离(fnl)培养：,第二十七页，共四十七页。,菌落(jnlu)(colony),纯培养(piyng)：,第二十八页，共四十七页。,菌种筛选(shixun),摇瓶试验(shyn),发酵罐中试验(shyn),发酵培养由实验室研究到产业化的过程,发酵生产,第二十九页，共四十七页。,3.培养基中生长现象(xinxing)：液体培养基,菌膜生长(shngzhng),沉淀(chndin)生长,混浊生长,混浊：大多数细菌 沉淀：链状生长的细菌菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌。,第三十页，共四十七页。,有鞭毛的细菌：试管中沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊生长；平皿中迁徙(qinx)样生长无鞭毛细菌：沿穿刺线线状生长或无扩散生长现象用于细菌的动力试验,无动力(dngl),有动力(dngl),迁徙生长,3.培养基中生长现象：半固体培养基,第三十一页，共四十七页。,菌落colony：在固体培养基上，一般经1824小时培养后，单个细菌即可繁殖成一堆肉眼可见(kjin)的细菌集团。不同细菌菌落在大小、形状、颜色、气味、透明度、表面光滑/粗糙、湿润/干燥、边缘整齐、溶血性不同,3.培养基中生长现象(xinxing)：固体培养基,第三十二页，共四十七页。,细菌的菌落一般(ybn)可分为三种：,光滑型菌落(smooth colony，S型菌落）：新分离的细菌大多呈光滑型菌落，表面光滑、湿润、边缘整齐。粗糙型菌落(rough colony，R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹(zhuwn)或颗粒状，边缘大多不整齐。黏液型菌落（mucoid colony，M型菌落）：菌落黏稠、有光泽，似水珠样。细菌多有厚荚膜或丰富粘液层。,粗糙型菌落,黏液型菌落,光滑型菌落,第三十三页，共四十七页。,水溶性色素(s s)（如铜绿假单胞菌）脂溶性色素（如金黄色葡萄球菌）,铜绿(tngl)假单胞菌,金黄色葡萄球菌(p to qi jn),第三十四页，共四十七页。,4.人工培养细菌(xjn)的用途,医学感染性疾病的病原学诊断 细菌学研究(ynji)生物制品的制备工农业生产基因工程中应用,第三十五页，共四十七页。,二、示教：,1、消毒灭菌的常用方法:物理-热力（干、湿热各两个）过滤器（3-4种）、冰箱、紫外线（两个）、超生波 化学(huxu)-高、中、低效消毒剂各类型2-3个代表；2、药敏实验：纸片法3、培养基的种类：见前解释、观察实物4、细菌生长现象观察：见前、观察实物,第三十六页，共四十七页。,药敏实验(shyn)：纸片法,第三十七页，共四十七页。,Zone Interpretive Criteria(mm),第三十八页，共四十七页。,三、操作：细菌(xjn)的接种培养,液体(yt)培养基 固体斜面培养基 半固体培养基,固体(gt)平皿培养基,第三十九页，共四十七页。,1.固体(gt)平皿培养基分离接种方法,右手执笔式握持接种环，在酒精灯火焰上烧灼接种环，待冷，取待测菌液一环。左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。持接种环在琼脂表面的1区涂布，划线时接种环与琼脂表面呈 3040的角度轻轻接触，利用腕力，切忌(qij)划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷后，将接种环在2区、3区划线数次，各线条间隔要小，但不能重叠。划完3区不需烧灼接种环，在4区作连续划线，如此反复至划完整个平皿（如图3）。,第四十页，共四十七页。,图1 接种环的握持方法,图2 平皿的握持方法,第四十一页，共四十七页。,接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间(shjin)、接种者等。然后将平皿的底朝上，放置在37孵箱内孵育24h。取出后观察琼脂表面的菌落分布情况，注意观察最后12区内是否分离出单个菌落，并观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、透明度、色素等情况）。,第四十二页，共四十七页。,2.固体斜面培养基接种(jizhng)方法,第四十三页，共四十七页。,3.半固体培养基接种(jizhng)方法,右手持接种(jizhng)针，灭菌冷却以接种针挑取菌种垂直刺入半固体培养基的中心，然后循原路退出。半固体琼脂培养基穿刺接种：主要是观察细菌有无动力。,第四十四页，共四十七页。,4.液体(yt)培养基接种方法,挑取少量菌苔或菌液，伸入待接种的培养基管内，在接近液面的管壁(un b)上轻轻研磨，并沾取少许培养液调和，使菌混合于其中,第四十五页，共四十七页。,【思考题】,一、细菌的生长繁殖与人工培养在医疗实践中有何意义？