MTT法检测细胞(xìbāo)活力甘肃中医药大学第第第第第第第第第第MTT法目的(mùdì)和意义检测细胞存活和生长情况(qíngkuàng)用于评价药物产生的细胞毒作用第第第第第第第第第第原理(yuánlǐ)•四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT•活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原(huányuán)为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。•在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。第第第第第第第第第第活细胞(xìbāo)+MTT琥珀酸脱氢酶紫蓝色结晶(jiéjīng)物Formazan第第第第第第第第第第贴壁细胞操作步骤1.接种(jiēzhòng)细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积90ul。（边缘孔用PBS或空白培养基填充）。2.培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板，大约12h），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药10ul，一般设5个复孔。3.5%CO2，37℃孵育分别孵育24小时后，倒置显微镜下观察。第第第第第第第第第第4.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。6.每孔加入100ul二甲基亚砜（置摇床上低速振荡10min，使结晶(jiéjīng)物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）第第第第第第第第第第悬浮(xuánfú)细胞操作步骤：•1）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约1×104/ml，每孔先加细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔10ul；共100ul加入到96孔板（边缘孔用PBS填充）。每板设对照。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设5个复孔。•2）置37℃，5%CO2孵育24小时，倒置显微镜下观察。•3）每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续(jìxù)培养4h•4）每孔加三联裂解液（10gSDS，异丁醇5ml，10MHCl0.1ml用双蒸水溶解配成100ml）过夜，第二天早晨置摇床上低速振...
