2022年医学专题—细胞破碎与分离设备(1).ppt

第六章 细胞(xbo)破碎与料液分离设备,第一页，共九十页。,细胞破碎就是采用一定的方法(fngf)，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。,细胞破碎(p su)定义,第二页，共九十页。,为了(wi le)研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种生物细胞壁的组成和结构。,细胞壁的组成(z chn)和结构,第三页，共九十页。,细菌 破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母 葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；霉菌 细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高；植物细胞 次生壁的形成提高(t go)了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。,第四页，共九十页。,常用破碎(p su)方法,第五页，共九十页。,机 械 法,第六页，共九十页。,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞(pn zhun)，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,1.珠磨法（Bead mill）,原理(yunl)：,第七页，共九十页。,第八页，共九十页。,实验室规模的细胞破碎(p su)设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法适用于细胞(xbo)悬浮液和植物细胞(xbo)的大规模处理。,第九页，共九十页。,第十页，共九十页。,2.高压(goy)匀浆法（High-pressure homogenization）,利用高压使细胞悬浮液通过(tnggu)针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理(yunl)：,大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用,第十一页，共九十页。,高压匀浆器的排出阀,第十二页，共九十页。,易造成(zo chn)堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌,不宜采用高压匀浆(yn jin)法的细胞类型。,影响匀浆破碎的主要因素：压力、温度(wnd)、通过匀浆器阀的次数,第十三页，共九十页。,大、中、小型高压匀浆器,第十四页，共九十页。,利用发射15-25kHz的超声波探头处理(chl)细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。,3.超声破碎(p su)法（Ultrasonication）,第十五页，共九十页。,影响超声波的细胞破碎效率因素：频率(pnl)、液体温度和粘度、处理时间等。超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。该法在实验室小规模细胞破碎中常用。,第十六页，共九十页。,第十七页，共九十页。,非 机 械 法,第十八页，共九十页。,1.酶溶法（Enzymatic Lysis）,（1）外加(wiji)酶法,常用(chn yn)的溶酶,溶菌酶-1，3-葡聚糖酶-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露(gnl)糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶等,第十九页，共九十页。,利用溶解(rngji)细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,第二十页，共九十页。,酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞(xbo)外形完整。,酶溶法的缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制(yzh)的存在。,第二十一页，共九十页。,诱发(yuf)微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,第二十二页，共九十页。,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质(wzh)有选择地渗透出来。,2.化学(huxu)渗透法（Chemical permeation）,第二十三页，共九十页。,Triton X-100牛黄(nihung)胆酸钠十二烷基磺酸钠,（1）表面(biomin)活性剂,表面(biomin)活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,第二十四页，共九十页。,主要是处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖(du tn)分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,（2）EDTA螯合剂,第二十五页，共九十页。,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。乙醇(y chn)、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（3）有机溶剂,与水中氢键作用，削弱溶质(rngzh)分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。盐酸胍和脲是常用的变性剂。,第二十六页，共九十页。,通用性差；时间长，效率(xio l)低；有些化学试剂有毒。,化学(huxu)渗透法优点：,缺点(qudin)：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,第二十七页，共九十页。,将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用(lyng)500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,其他(qt)方法,1.X-press法,第二十八页，共九十页。,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程(guchng)中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,2.渗透压法（Osmotic pressure）,第二十九页，共九十页。,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢(hunmn)融化，反复多次而达到破壁作用。一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。,3.反复冻结(dngji)-融化法,第三十页，共九十页。,此法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。气流干燥(gnzo)主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。,4.干燥(gnzo)法,第三十一页，共九十页。,破碎(p su)率的测定与破碎(p su)技术的研究方向,1.破碎率的测定(cdng),直接(zhji)测定法（革兰氏染色法）目的产物测定法导电率测定法,第三十二页，共九十页。,2.破碎技术(jsh)的研究方向,多种破碎(p su)方法相结合与上游过程相结合与下游工程相结合,第三十三页，共九十页。,定 义：在一定的压力(yl)差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。,一、过滤(gul),固液分离(fnl)设备,第三十四页，共九十页。,过滤(gul)介质,无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等成形颗粒：烧结金属、烧结塑料(slio)以及用合成树脂粘结的硅砂、塑料(slio)颗粒等，做成圆筒形或板状。非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维滤布、短纤维滤布。金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。,第三十五页，共九十页。,过滤设备(shbi)的分类,根据推动力的不同可分为四类重力过滤自然(zrn)过滤加压过滤板框过滤真空过滤真空过滤器离心过滤离心过滤器,第三十六页，共九十页。,过滤(gul)设备,板框过滤机板框压滤机由压滤机滤板、液压系统、压滤机框、滤板传输系统和电气系统等五大部分组成。板框压滤机工作(gngzu)运行的原理：先由液压施力压紧板框组，料液由中间进入，分布到各滤布之间，通过过滤介质而实现固、液分离的脱液方法。,第三十七页，共九十页。,广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌(xjn)（需预处理）等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。,第三十八页，共九十页。,滤板与滤框的工作(gngzu)情况,第三十九页，共九十页。,优点：结构简单、装配紧凑、过滤面积大、允许采用较大的操作压力，辅助设备少，动力消耗小，过滤和洗涤质量好，对固形物含量要求低，材料选择范围广。缺点：设备笨重、占地面积多、辅助时间长、生产(shngchn)效率低。,第四十页，共九十页。,板框过滤机,第四十一页，共九十页。,第四十二页，共九十页。,在滤板的外缘有一个钮的称为过滤板，三个钮的称为洗涤板，在滤框的外缘铸有两个钮。从图8-2可以看出，1是过滤板，2是滤框，3是洗涤板。板和框是按照钮的记号1-2-3-2-1的顺序排列的。滤板和滤框的构造如图所示。滤板表面上有棱状沟槽，其边缘略微突起。在板、框和滤布的两个角都有小孔，它们组合(zh)并压紧后即构成了供滤液和洗涤水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框和滤布围成了容纳滤浆和滤饼的空间。滤板的作用有二：一是支撑滤布；二是滤液流出的通道。,第四十三页，共九十页。,操作前，应将板、框和滤布按前述顺序排列，并转动机头，将板、框和滤布压紧。操作时，悬浮液在压力(yl)下经悬浮液通道和滤框的暗孔进入框内。滤液分别穿过两侧滤布，沿板上沟槽流下，汇集于下端，经滤液出口阀流出。然后将滤框和滤布洗净，重新装合，准备下一次过滤操作。但是，多数情况滤饼装满后还需洗涤，有时还需压缩空气吹干。所以，板框式过滤机的一个工作周期包括装合，过滤，洗涤（吹干），去饼，洗净等过程。过滤和洗涤过程的情况见图。,第四十四页，共九十页。,第四十五页，共九十页。,真空(zhnkng)转鼓过滤机,第四十六页，共九十页。,（1）过滤区 当浸在悬浮液内的各扇形格同真空管路接通时，格内为真空。在转筒外压力差的作用下，滤液透过滤布，被压入扇形格内，经分配头被吸出。而固体颗粒在滤布上则形成一层逐渐增厚的滤渣。（2）洗涤吸干区域 当扇形格离开悬浮液进入此区时，格内仍与真空管路相通。滤饼在此格内将被洗涤并吸干，以进一步降低滤饼中溶质的含量。有些(yuxi)特殊设计的转鼓过滤机上还设有绳索（或布）压紧滤饼或用滚筒压紧装置，用以压榨滤饼、降低液体含量并使滤饼厚薄均匀防止龟裂。,第四十七页，共九十页。,（3）卸渣区 这个区与分配头的室相接通，在室通入压缩空气，压缩空气促使滤饼与滤布分离，然后将滤饼清除。（4）滤布复原区 滤渣被刮落后，为了除去堵塞在滤布孔隙中的细微颗粒，压缩空气通过分配头的室进入复原区的滤室，吹落这些颗粒使滤布复原，重新开始下一循环的操作。因为转鼓不断旋转，每个滤室相继