NY∕T 545—2023 猪痢疾诊断技术.pdf

NY/T545-2023前言本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替NY/T545-2002猪痢疾诊断技术，与NY/T545-2002猪痢疾诊断技术相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a)修改了猪痢疾的病原名称（见2002年版的前言）；b)增加了术语和定义（见第3章）；c)增加了生物安全要求（见第5章）；d)增加了猪痢疾短螺旋体的PCR检测方法（见第10章）；e)增加了综合判定（见第11章）；f)增加了鉴别诊断（见第12章）；g)增加了生理盐水、磷酸盐缓冲液、15g/L琼脂凝胶的配制方法（见附录A中的A.1、A.2、A.4);h)增加了病原、组织病理、平板培养及PCR电泳图片（分别见附录B中的B.1、B.2、B.3和附录D中的D.1);i)增加了厌氧产气包说明的附录（见附录C);j)删除了肠致病性实验操作部分（见2002年版的7.3.3.2）；k)删除了厌氧培养装置及使用方法（见2002年版的附录A)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本文件起草单位：山东农业大学、上海市动物疫病预防控制中心、赤峰市农牧业综合行政执法支队。本文件主要起草人：李建亮、张维谊、王一新、王晓旭、崔言顺、徐锋、王建、马志强、徐瑞雪、杨萍萍、衣婷婷。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：2002年首次发布为NY/T545-2002;一本次为第一次修订。INY/T545-2023猪痢疾诊断技术1范围本文件规定了猪痢疾的临床诊断、粪便和大肠组织中猪痢疾短螺旋体显微镜检查、分离培养，以及PCR检测的技术要求、综合判定及鉴别诊断。本文件适用于猪痢疾的诊断。本文件所规定的粪便中猪痢疾短螺旋体显微镜检查不适用于急性病例后期、慢性及投药后病例。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T541兽医诊样品采集、保存与运输技术规范SN/T1207猪疾检疫技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猪疾swine dysentery曾称为猪密螺旋体痢疾、血痢、黏液出血性腹泻或弧菌性痢疾，是由猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteriae,B.h)引起猪的一种严重的肠道传染病。其特征是黏液性或黏液出血性腹泻，大肠黏膜发生卡他性出血性炎症，有的发展为纤维素性坏死性炎症。3.2猪痢疾短螺旋体Brachyspira hyodysenteriae猪痢疾短螺旋体是猪痢疾的病原，存在于猪的病变肠段黏膜、肠内容物及粪便中，对外界环境有较强的抵抗力，过去常称为猪痢疾密螺旋体或猪痢疾蛇形螺旋体。3.3投药后病例 diseased pig of taking medication已被投喂泰乐菌素、杆菌肽等对猪痢疾短螺旋体敏感的药物的猪只。3.4聚合酶链式反应polymerase chain reaction用于扩增位于两端已知序列之间DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)的方法。模板DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不相补的寡核苷酸片段即引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP(deoxyribonucleo-side triphosphate,脱氧核苷三磷酸)为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两端已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个30个扩增循环，扩增倍数达到约106。NY/T545-20234缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)dNTP:脱氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside triphosphate)NADH:还原型辅酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide)nox:NADH氧化酶(NADH oxidase)PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline)PCR:聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)SD:猪疾(Swine Dysentery)TAE:Tris 乙酸盐 EDTA缓冲液(Tris Acetate-EDTA buffer)Taq:DNA酶(TaqDNApolymerase)TSA:胰蛋白胨大豆琼脂(Trypticase Soy Agar)5生物安全要求样品采集、处理及检测过程中涉及的实验操作应符合GB19489、GB/T27401、NY/T541、SN/T1207的相关规定。6临床诊断6.1流行病学6.1.1猪痢疾在自然流行中只发生于猪。各种年龄、品种、性别的猪均易感，但保育后期至育肥前期猪(1.5月龄4月龄)发生较多，而哺乳仔猪、成年猪发病率低。6.1.2本病主要通过粪便污染而经消化道感染。阴雨潮湿、气候多变等各种应激因素，均可促进本病的发生。6.1.3本病无明显季节性，流行经过比较缓慢，持续期较长，多数病猪转为慢性，康复后（自然康复或治疗后)可复发或多次复发，很难根除。6.2临诊症状6.2.1潜伏期2d至2个月不等，自然感染一般为1周2周。6.2.2临床症状6.2.2.1最急性型多见于暴发本病之初，表现急性剧烈腹泻，排便失禁，呈高度脱水状态而迅速死亡。病程12h24h。6.2.2.2急性型病初多排软粪或稀粪。随后，粪便中出现大量黏液和血液（凝块），呈油脂样、蛋清样或胶冻状。粪色为棕色、红色或黑红色不一。病猪迅速消瘦，常转为慢性或死亡。病程1周2周。6.2.2.3亚急性或慢性型黏液出血性下痢时轻时重，生长发育停滞，常呈恶病质状态。部分康复猪经一定时间可复发。病程4周以上。6.3病理变化6.3.1主要病变见于大肠，其他组织器官均无特征性病变。6.3.2早期病变常出现在结肠旋袢顶部，随病情进一步发展可蔓延至盲肠、整个结肠和直肠前段。急性病例表现为黏液性、出血性和纤维素性渗出，肉眼可见大肠黏膜充血、肿胀和出血，并有胶胨样附着物，常混有血液和纤维素。严重时，黏膜表面有散在性或弥散性糠麸样或干酪样坏死物覆盖，刮去后露出不规则2NY/T545-2023糜烂出血溃疡面。6.3.3组织病理学检查，早期病例的肠黏膜上皮与固有层分离，微血管外露而发生灶性坏死。当病理变化进一步发展时，肠黏膜表层细胞坏死，黏膜完整性受到不同程度的破坏，并形成伪膜。在固有层内有多量炎性细胞浸润，肠腺上皮细胞不同程度变性、萎缩和坏死。黏膜表面及腺窝内可见数量不一的猪痢疾短螺旋体，但以急性期数量较多，有时密集呈网状。病理变化局限于黏膜层，一般不超过黏膜下层，其他各层保持相对完整性。7粪便及肛拭子中猪痢疾短螺旋体显微镜检查7.1主要仪器与试剂7.1.1光学显微镜。7.1.2暗视野镜头。7.1.3载玻片。7.1.4盖玻片。7.1.5酒精灯。7.1.6草酸铵结晶紫染色液（革兰氏染色第一液）或10倍稀释的石炭酸复红。7.1.7生理盐水。7.1.8样品7.1.8.1待测样品猪新鲜粪便（含黏液）或直肠拭子或大肠内容物及黏膜。7.1.8.2阳性对照含猪痢疾短螺旋体的菌苔或菌液。7.1.8.3阴性对照不含猪痢疾短螺旋体的生理盐水。7.2操作步骤7.2.1悬滴样品制作取待测样品少许悬于少量生理盐水（配制方法按照附录A中的A.1规定执行）中，做成悬滴样品后镜检。同时，制作阳性对照、阴性对照悬滴样品。7.2.2染色样品制作取少许待测样品抹片，干燥，火焰固定，以草酸铵结晶紫液或稀释的石炭酸复红染色2min3min,水洗，吸干后待检。每份样品最少制片2张。同时，制作阳性对照、阴性对照抹片。7.2.3显微镜检查悬滴样品在暗视野（或暗光）显微镜下观察，染色样品以油镜直接观察。每片样品至少观察10个视野。7.3结果判定7.3.1若悬滴样品在暗视野下可观察到同阳性对照中相似的长6m8.5m、呈2个5个疏螺旋状、两端尖锐、呈蛇样活泼运动的菌体，同时阴性对照中无此菌体时，判为样品猪痢疾短螺旋体阳性。7.3.2染色观察当阳性对照为染色阳性、阴性对照为染色阴性时，试验结果成立。染色样品中，若无螺旋体着色，则判为阴性。检测样本中有1个以上的重复切片中呈染色阳性时（见附录B中的B.1),即判该样本为猪痢疾短螺旋体阳性；否则判为阴性。7.3.3当视野中有数量较多(3条5条或以上)猪痢疾短螺旋体时，在获菌落、溶血性等培养结果前，可作为诊断的重要参考依据。8大肠组织中猪痢疾短螺旋体显微镜检查（组织病理学观察）8.1材料准备3