NLRP3炎症小体在小鼠手...诱导全身性炎性反应中的作用_蒋鑫.pdf

宁夏医科大学学报45卷手术是现代医学治疗疾病的重要方式，但手术创伤引发的并发症近年越来越受到关注，大量临床研究表明，术后并发症多以炎性反应为基础1-2，如心脏手术后的急性肾损伤3、认知功能障碍以及腹部大手术后的肺损伤4-5。因此，如何有效防治术后炎性反应成为亟须解决的临床问题6-7。NLRP3（NOD-like receptor protein 3）是NOD 样受体蛋白家族成员，其在 NLRP3 炎症小体中承担着接收炎性信号的作用8。NLRP3 主要由 3 个结构域组成，包括中央核苷酸结合和寡聚化（NACHT）结构域，富含亮氨酸的重复序列（LRR）以及 pyrin 结构域（PYD）9。当肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）和白细胞介素（interleukin，IL）-1 等炎性信号刺激 LRR 后，NACHT 结构域会促使 PYD 结构域与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）结合，将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 前体（pro-caspase-1）剪切成活化的caspase-110-11，活化的 caspase-1 将促进 IL-1 和IL-18 剪切成熟12，诱发炎性级联反应13-15，造成多个器官损害16-18。虽然 NLRP3 炎症小体活化是炎性发展的关键因素之一，但 NLRP3 炎症小体是否参与外周手术诱导全身无菌性炎性反应尚不明确。为此，本研究通过动物实验来探讨 NLRP3 炎症小体在外周手术介导的全身性炎性反应中的作用，以期为炎性相关术后并发症的防治提供实验基础。1材料与方法1.1材料本研究通过了宁夏医科大学伦理委员会批准（2018-020）。14 只 8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠（253）g 采购并饲养于宁夏医科大学实验动物中心。NLRP3 抗体（ab263899）购于 Abcam 公司。BCA 蛋白定量试剂盒购自凯基生物技术股份有限公司。IL-1（EK0394）和 IL-18（EK0433）ELISA试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。总RNA 提取试剂盒（AP-MX-MS-RNA-10G）购自康宁公司，第一链 cDNA 合成试剂盒、定量 PCR 试剂盒（AQ601）均购自北京全式金生物技术股份有限公司，所有引物由通用生物（安徽）股份有限公收稿日期：2022-11-21基金项目：国家自然科学基金项目（81860213）；宁夏自然科学基金项目（2022AAC02061）作者简介：蒋鑫（1990），男，在读硕士研究生，研究方向：术后认知功能障碍的机制与预防。E-mail：jiangxin_通信作者：马刚，男，硕士研究生导师，研究方向：术后认知功能障碍的机制与预防。E-mail：NLRP3 炎症小体在小鼠手术模型诱导全身性炎性反应中的作用蒋鑫1，2，任艺1，3，柳媛媛4，汪蕊1，3，马刚2（1.宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2.宁夏医科大学总医院麻醉科，银川750004；3.宁夏医科大学总医院消化内科，银川750004；4.宁夏医科大学基础医学院，银川750004）摘要：目的探讨全身性炎性反应中 NLRP3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的作用。方法将8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠随机分为对照组和手术组（每组 7 只），双侧颈动脉暴露手术后 24 h 收集小鼠血浆、肝脏、脾脏和脑组织，采用定量聚合酶链式反应法（qPCR）检测不同组织中白细胞介素（interleukin，IL）-1和 IL-18 的 mRNA 表达水平，采用 Western blot 检测 NLRP3 蛋白表达水平，酶联免疫吸附法（ELISA）检测 IL-1 和 IL-18 浓度。结果与对照组相比，手术组小鼠血浆 IL-1 表达水平增高（P0.01），肝脏和脾脏 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA 和 NLRP3 蛋白也增加（P 均0.05）。在脑组织中，与对照组相比，手术组小鼠 IL-1 和 IL-18的 mRNA 水平均增高（P均0.05）。ELISA 法检测结果显示，手术组小鼠脑组织 IL-1 和 IL-18 蛋白水平均高于对照组（P 均0.01）。Western blot 结果显示，手术组 NLRP3 蛋白水平较对照组增多（P0.05）。结论手术介导的全身性炎性反应与 NLRP3 炎症小体途径有关。关键词：手术；NLRP3 炎症小体；全身性炎性反应中图分类号：R364.5文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.04.007文章编号：1674-6309（2023）04-0370-06论著第 45 卷4 期2023 年 4 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University3704期司合成。1.2方法1.2.1动物模型建立小鼠饲养环境整洁安静，饲养条件维持 12 h/12 h 白昼循环光照，室温（242），相对湿度 60%80%，小鼠自由摄食和饮水。适应性饲养 1 周后，随机分为对照组和手术组（7 只/组）：对照组不做任何处理；手术组依据文献方法19，采用双侧颈动脉剥脱手术，即禁食 12 h 后称重，然后经腹腔注射 4%的水合氯醛（按剂量：0.1 mL/10 g）麻醉，颈前部剃毛，采用碘伏消毒。麻醉诱导 10 min 后，切 2.2 cm 的中线颈部切口，分离出 1 cm 长的双侧颈动脉，在避免损伤迷走神经的情况下，机械刺激血管壁 100 次。生理盐水冲洗伤口后，缝合手术部位。全程在无菌条件下进行，持续 30 min。麻醉期间，恒温加热毯维持小鼠体温在 37 C。处理 24 h 后，麻醉小鼠并采集小鼠血液样本，颈椎脱臼处死小鼠后收集肝组织、脾组织及脑组织用于后续实验。1.2.2定量 PCR 检测不同组织 IL-1 和 IL-18mRNA 表达采用动物组织总 RNA 提取试剂盒在术后 24 h 提取小鼠肝脏、脾脏和脑组织中总RNA，参照第一链 cDNA 合成试剂盒说明书进行逆转录反应。取逆转录反应产物，参照 mRNA 实时荧光定量试剂盒说明书实施 qPCR 扩增。反应程序：94 30 s，94 5 s，60 30 s，共 44 个循环，GAPDH 为 mRNA 内参，经 2 Ct计算mRNA 相对表达量（表 1）。引物上游引物 5-3下游引物 5-3IL-1GAAATGCCACCTTTTGACAGTGTGGATGCTCTCATCAGGACAGIL-18AGTGAACCCCAGACCAGACTTCAGGTGGATCCATTTCCTCAAGAPDHGGTGAAGGTCGGTGTGAACGCTCGCTCCTGGAAGATGGTG表 1qPCR 采用的引物序列1.2.3Western blot 检测不同组织 NLRP3 蛋白表达情况术后 24 h 收集各组小鼠肝组织、脾组织和脑组织，用超声研磨仪在 4 条件下研磨1 min，并于冰上进行 30 min 裂解。随后，4、12 000g 离心 10 min 并收集上清液。BCA 法测定总蛋白浓度，进行 SDS-PAGE（120 V，60 min）。经 90 min 转膜后，用 50 g L-1脱脂牛奶封闭 1 h；兔抗 NLRP3 单克隆抗体（110 000）、兔抗-actin多克隆抗体（110 000）、兔抗 GAPDH 多克隆抗体（110 000）4 孵育过夜。洗膜后，加入 HRP标记的山羊抗兔 IgG（120 000），室温孵育 1 h。TBST 清洗后加入 ECL 反应底物并在暗室曝光和底片扫描，通过 Image J 计算蛋白质条带灰度值。1.2.4炎性因子 IL-1 和 IL-18 表达的检测采用 ELISA 检测试剂盒检测 IL-1 和 IL-18 浓度，收集各组全血和脑组织进行样品制备；血浆：全血于 4 1 000g 离心 10 min，取血浆检测；脑组织：组织按比例（100 mg 组织加入 1 mL 裂解液）与组织裂解液混合冰上裂解 30 min，4 11 000g 离心 5 min 取上清液检测。ELISA 试剂盒室温（2528）平衡 30 min；配制 1洗涤液；取出所需板条放置在框架内。设置标准孔和样本孔并加入标准品或待测样本；加入生物素标记抗体；37 恒温孵育 30 min；加入洗涤液反复洗板5 次；加入酶标抗体；恒温孵育结束后反复洗板5次；加入底物 A 和 B，混匀后封住反应孔孵育15 min；加入终止液终止反应，混匀后立即上机检测各孔的光密度（OD）值。以标准品浓度为横坐标，对应 OD 值为纵坐标在 Excel 工作表中绘制标准曲线，R20.99，按照曲线方程式得出各样本浓度。1.3统计学方法采用 GraphPad Prism 8.01 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数标准差（xs）表示，两样本比较采用 t 检验，P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1手术诱发小鼠血浆炎性因子表达水平变化ELISA 法检测小鼠血浆炎性因子水平结果显示，术后24h手术组小鼠血浆中IL-1水平 （14.020.83）pg mL-1 高于对照组 （11.470.23）pg mL-1（P0.01）。2.2手术诱发小鼠肝脏 IL-1 mRNA、IL-18mRNA 和 NLRP3 蛋白表达水平变化qPCR 和 Western blot 检测结果表明，与对照组相比，手术组小鼠 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA和 NLRP3 蛋白水平均增高（P 均0.05），见图 1。2.3手术诱发小鼠脾脏 IL-1、IL-18 mRNA 和NLRP3 蛋白表达水平变化qPCR 和 Western blot 结果显示，与对照组相比，手术组小鼠脾脏组织 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA 和 NLRP3 蛋白水平均增高（P 均0.05），见图 2。蒋鑫，等.NLRP3炎症小体在小鼠手术模型诱导全身性炎性反应中的作用371宁夏医科大学学报45卷2.4手术对脑组织 IL-1 mRNA、IL-18 mRNA及其蛋白和 NLRP3 蛋白表达的影响qPCR 结果表明，手术组小鼠 IL-1 和 IL-18 的 mRNA 水平均高于对照组（P 均0.05）。ELISA 法检测结果显示，手术组小鼠脑组织 IL-1 和 IL-18 蛋白水平均高于对照组（P 均0.01）。Western blot 结果显示，手术组 NLRP3 蛋白水平较对照组增多（P0.05），见图 3。3讨论手术可以导致全身性炎性反应，若不能有效控制，则会引发一系列术后并发症20-22。本实验参考相关文献19，制作经典的颈动脉剥脱手术模型来观察手术对血浆、脑、肝脏等器官炎性反应的影响。本研究发现，小鼠术后 24 h 外周血中 IL-1较对照组增高，表明手术可以诱发血中炎性因子表达增高。研究23表明，手术可引起外周循环 IL-1 等炎性因子表达增高。但关于 NLRP3 炎症小体在其中作用的研究较少。NLRP3 炎症小体激活后可介导多种炎性疾病的发生、发展，推测手术后局部无菌性炎性反应可通过炎性因子和免疫细胞激活 NLRP3 炎症小体，产生更多的 IL-1，加重肝脏、脾脏、脑等重要器官损伤。肝脏存在大量的巨噬细胞等免疫细胞，这些细胞中含有丰富的 NLRP3 蛋白，NLRP3 在肝脏的急性损伤过程中起着关键作用24。本研究结果显示，肝组织中 NLRP3、IL-1 和 IL-18 表达在术后 24 h 增高，表明手术通过激活 NLRP3 炎症小体导致肝脏产生炎性反应。近期一项关于脾脏焦亡的研究发现，NLRP3、IL-1 和 IL-18 发挥着至关重要的作用25。本研究结果显示脾脏 NLRP3、IL-1 和 IL-18 表达增高，表明手术可通过NLRP3 炎症小体影响到脾脏的炎性反应。脑是炎症发生后最易受炎性因子侵犯的器官之一。炎性因子可通过直接和间接途径通过血脑屏障，引发大脑炎性级联反应20。大量的 IL-1积累可以引起神经细胞不同程度的损伤，从而影响到