Connexin_43-膜...途径参与房颤发生的机制研究_王婷.pdf

基金项目:陕西省人民医院拔尖人才项目(2021BJ 03)作者简介:王婷，女，1990 04 生，在读硕士，主治医师，E-mail:874029140 qq com收稿日期:2022 11 09Connexin 43 膜纳米管 Ca2+信号途径参与房颤发生的机制研究王婷1，刘洁2，胡苏3，赵娜1，王军奎1，李博涛1*(1西安医学院附属陕西省人民医院心内一科，西安710068;2蒲城县医院心内科;3西安医学院第二附属医院心内科;*通讯作者，E-mail:1842954208 qq com)摘要:目的探讨膜纳米管(membrane nanotubes，MNTs)参与心房颤动(atrial fibrillation，AF)发生的作用机制。方法8 周龄雄性 SD 大鼠随机分为电刺激组和假手术组，每组 10 只。电刺激组经食道高频心房起搏进行电刺激诱导建立大鼠 AF 模型，假手术组不予心房起搏电刺激。分离两组大鼠心房肌细胞建立细胞水平电刺激组与假手术组，在此基础上，给予电刺激组心房肌细胞 MNTs 结构抑制剂 Cyto D 建立细胞水平电刺激+Cyto D 组。利用免疫荧光染色评估心房肌细胞之间的 MNTs变化;应用细胞内钙离子(calcium ion，Ca2+)荧光钙探针标记心肌细胞中 Ca2+，随后利用流式细胞术检测荧光探针标记的Ca2+变化;采用蛋白免疫印迹法检测缝隙连接蛋白 43(Connexin 43)的蛋白水平表达。结果应用经食道高频心房起搏电刺激成功建立大鼠 AF 模型。与假手术组相比，电刺激组心房肌细胞之间 MNTs 连接增多增粗，钙信号显著增强(P 0 01)。与电刺激组相比，电刺激+Cyto D 组 MNTs 减少变细，钙信号显著减低(P 0 05)，Connexin 43 蛋白表达水平显著下调(P 0 01)。结论Connexin 43 参与 MNTs 诱发钙信号增加触发晚后除极诱发 AF 发生。关键词:房颤;膜纳米管;钙离子;缝隙连接蛋白 43;大鼠;电刺激中图分类号:54175文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0454 05DOI:1013753/j issn1007 66112023 04 007Mechanism of Connexin 43-membrane nanotubes-Ca2+signaling pathway involving in atrial fibrillationWANG Ting1，LIU Jie2，HU Su3，ZHAO Na1，WANG Junkui1，LI Botao1*(1First Department of Cardiology，Shaanxi ProvincialPeople s Hospital Affiliated to Xi an Medical University，Xi an 710068，China;2Department of Cardiology，Pucheng County Hospital;3Department of Cardiology，Second Affiliated Hospital of Xi an Medical University;*Corresponding author，E-mail:1842954208 qq com)Abstract:ObjectiveTo explore the action mechanism of membrane nanotubes(MNTs)involved in atrial fibrillation(AF)MethodsEight-week-old male SD rats were randomly divided into electric stimulation group and sham operation group，with 10 rats in eachgroup The AF model of rats was established through high frequency atrial pacing of esophagus in electric stimulation group，while therats in sham operation group were not stimulated by atrial pacing Atrial myocytes were isolated from the rats in two groups，respectively，namely electrical stimulation group and sham-operation group，and the atrial myocytes after electrical stimulation were treated with CytoD(MNTs structural inhibitor)in electrostimulation+Cyto D group Changes of MNTs between atrial myocytes were evaluated by immu-nofluorescence staining Intracellular calcium ion(Ca2+)fluorescent calcium probes were used to label Ca2+in cardiomyopathy，andflow cytometry was utilized to detect Ca2+changes The protein level of Connexin 43 was observed by Western blotesultsThe ratmodel of AF was successfully established by high frequency atrial pacing Compared with sham operation group，MNTs connectionbetween atrial myocytes in electrical stimulation group was increased and became thicker，and the calcium signal was significantlyenhanced(P001)Compared with electrical stimulation group，the MNTs were decreased and became thinner in electrostimulation+Cyto D group，the calcium signal was significantly decreased(P0 05)，and the expression level of Connexin 43 protein was signifi-cantly down-regulated(P 0 01)ConclusionConnexin 43 is involved in AF induced by MNTs-induced calcium signal increasetriggering late afterdepolarizationKey words:atrial fibrillation;membrane nanotubes;Ca2+;Connexin 43;rats;electric stimulation心房颤动(atrial fibrillation，AF)简称“房颤”，是临床上最常见的心律失常，据全球疾病负担(globalburden of disease，GBD)数据库统计，截止 2017 年，全球约有3 760万人口罹患 AF，AF 导致的危害主要包括脑卒中、心力衰竭及体循环栓塞，伴随致残及致死风险增高1。迄今为止，关于 AF 发生的机制研究尚未完全明了。心房异位局灶兴奋触发电活动是 AF 发生的重要机制之一2。触发活动包括两种类型:早后除极(early afterdepolarization，EAD)及晚后除极(delayedafterdepolarization，DAD)。触发活动发生于动作电位时程(action potential duration，APD)结束之后，即动作电位(action potential，AP)静息 4 相时，肌浆网释放钙离子(calciumion，Ca2+)增加，钠钙交换体454J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4(Na-Ca exchanger，NCX)将细胞外 Na+泵入细胞内，将细胞内 Ca2+泵出细胞外，产生瞬时内向除极电流(transient inward current，Iti)，即形成 DAD，DAD 诱发的心肌细胞电活动参与 AF 的发生已被证实3，4。膜纳米管(membrane nanotubes，MNTs)是一种直径 50 200 nm、延续于 2 个完整细胞膜、连接 2个细胞之间的生物学结构，与细胞膜结构一致，包含脂质双分子层和肌动蛋白5。MNTs 具备运输如Ca2+、内质网、线粒体、溶酶体等各种信号分子及各种细胞器的生物学作用6，7。目前没有相关 MNTs参与 AF 发生机制的具体研究，因此，本研究通过利用免疫荧光染色评估心房肌细胞之间的 MNTs 变化来探讨心房肌细胞 MNTs 是否参与 AF 的发生，进一步探究其在 AF 发生中具体的调控机制。1材料与方法1 1AF 大鼠模型制作及实验对照处理将20 只8 周龄雄性 SD 大鼠(SPF 级，西安交通大学动物实验中心，体质量(180 83 6 32)g，随机分为电刺激组和假手术组，每组 10 只。采用经食道高频电刺激快速心房起搏诱导大鼠 AF 发作建立AF 大鼠模型8，9，设为电刺激组。实验过程中，AF大鼠采用戊巴比妥(50 mg/kg，腹腔内注射)进行麻醉;取仰卧位固定，四肢皮下描记大鼠标准导联心电图记录;备皮，沿正中线切开皮肤，暴露气管，利用自制气管插管行气管插管术维持大鼠呼吸，同时连接小动物呼吸机辅助呼吸;经大鼠口腔插入至心房后方食道内起搏电极(苏州电子仪器厂，规格:头端2 个直径 2 mm 的环状电极，电极间隔 2 mm)，深度约为 7 cm，保持起搏电极前端自然弯曲紧贴左心房，根据心房心电图捕获情况适时调整电极深度，电极尾端连接生理药理电子刺激仪，经高频电刺激实现食道快速心房起搏诱发大鼠 AF 发作。刺激参数具体如下:刺激波形为方形波，连续波输出;脉冲宽度6 ms，间隙 20 ms;刺激频率约 1 200 次/min;电压20 V，电流2 mA;刺激时间:第1 天，30 s/次，间隔 5 min，每天行 1 组刺激(每组 5 次)，间隔 4 d行第 2 组刺激;大鼠 AF 稳定发作 7 d 以上。假手术组除不进行心房起搏电刺激外，其余步骤同电刺激组。大鼠 AF 稳定发作，判读 AF 发作时心电图标准为:正常心房 P 波消失，f 波出现，中间无等电位线。1 2大鼠心房肌细胞分离深度麻醉，开胸取出电刺激组及假手术组大鼠心脏，参考既往文献分离大鼠心房肌细胞10:分离大鼠心房肌组织，弃去其他组织，生理盐水洗净后置于 4 D-Hanks 平衡盐溶液中反复冲洗 3 次;将心房肌组织用眼科剪剪成 1 mm3大小组织块，置入胰蛋白酶溶液，37 水浴 8 min，弃去上层混悬液;胶原酶溶液(015 ml，质量分数1%)37 水浴并搅拌 35 min，吸取上层混悬液，置于预冷 10%达尔伯克氏必需基本培养基(Dulbecco s minimumessential medium，DMEM)中终止反应;所得沉淀物加入胶原酶溶液(0 15 ml，质量分数 1%)37 水浴并搅拌 35 min，吸取全部液体，终止反应;所得混悬液用 300 目滤网滤过除去未消化组