Hippo_MST1对老龄...期小鼠认知功能的影响及机制_展巧稚.pdf

宁夏医科大学学报45卷收稿日期：2022-05-29作者简介：展巧稚（1989），女，在读硕士研究生，研究方向：围术期器官保护。E-mail：通信作者：阎文军（1971），女，教授，硕士研究生导师，研究方向：围术期器官保护。E-mail：围术期神经认知障碍（perioperative neurocognitive disorders，PND）是手术和麻醉过程中常发生的中枢神经系统并发症。在老年人群（60 岁）中患病率增加。PND 可以影响不同的认知领域，如语言记忆、语言理解、视觉记忆、注意力和执行功能1，最明显的主观症状是记忆能力缺陷和执行能力下降2。PND 通常是自限性的，但它可以持续数月甚至数年，甚至可能变成永久性疾病。目前对 PND 的发病机制尚不清楚。由手术创伤引起的外周炎症和全身的释放会影响中枢神经系统的炎症过程3，并且其水平的高低与认知功能障碍的严重程度相关，尤其是在记忆和学习方面4-5。哺乳动物系不育 20 样激酶 1（mammaliansterile 20-like kinase 1，MST1），属于 Ste-20 家族的类 GC 激酶，MST1 基因位于人类染色体20q11。MST1 是 Hippo 信号通路中的主要成员，通过调节细胞增殖和分化来调节生物大小6。细胞高表达 MST1 在细胞凋亡以及促进潜在的炎性反应中起重要作用7-8。反之，当细胞中缺乏MST1 则会抑制促炎性细胞因子产生9。因此，MST1被认为是神经炎症的重要正性调节剂。但其在围术期神经认知障碍中的作用还未见相关研究报道。本研究通过观察老龄 PND 小鼠术后各个时间点 Hippo 通路关键分子 MST1、P-MST1 的表达情况，探讨调控 Hippo/MST1 信号通路对老龄Hippo/MST1 对老龄围术期小鼠认知功能的影响及机制展巧稚1，阎文军1，2（1.宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2.甘肃省人民医院麻醉科，兰州730000）摘要：目的探讨 MST1 激活对老龄围术期神经认知障碍（PND）小鼠学习记忆功能的影响及可能机制。方法将 48 只老年雄性 C57BL/6J 小鼠随机分为假手术组（Sham 组）和手术组（PND 组），每组 24 只，胫骨骨折髓内钉固定术制备 PND 模型，术前 6 d 连续对小鼠行水迷宫定位航行训练，术后 1、5、7、14 d 行空间探索实验检测小鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间百分比、穿台次数，评估小鼠的记忆能力。水迷宫实验结束后立即将动物处死，Western blot 检测脑海马组织 P-MST1、MST1 的表达。另将 40 只小鼠随机分为 4 组（n=10）：Sham 组、PND 组、PND+Vehicle 组、PND+XMU-MP-1 组。麻醉前半小时和术后每天于相同时间点腹腔注射 XMU-MP-12 mg kg-1，连续 7 d，PDN+Vehicle 组于相同时间点腹腔注射等量溶剂。术后第 7 天对各组小鼠行水迷宫空间探索实验后立即处死取材，Western blot 法检测小鼠海马组织 P-MST1、MST1 表达，ELISA 法检测小鼠海马组织匀浆液 TNF-、IL-1 水平。结果造模结果（水迷宫空间探索实验）显示，与 Sham 组相比，PND 组小鼠在术后 1、5、7 d 的潜伏期延长，目标象限停留时间百分比缩短，穿台次数减少（P 均0.01）；术后 14 d 基本恢复正常水平（P0.05），老龄小鼠的游泳速度无变化。Western blot 结果显示，与 Sham 组比较，术后 1、5、7、14 d老年 PND 小鼠海马区 P-MST1 表达均升高（P 均0.01），术后第 7 天 P-MST1 达峰值，术后第 14 天 P-MST1表达较第 7 天下降。与 Sham 组比较，MST1 总蛋白的表达无变化（P0.05）。使用 XMU-MP-1 阻止 P-MST1 蛋白表达后，水迷宫空间探索结果显示，与 PND 组比较，PND+XMU-MP-1 组小鼠逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间百分比延长，穿台次数增加（P 均0.05）。Western blot 检测结果显示，与 PND 组比较，PND+XMU-MP-1 组 P-MST1 的蛋白表达降低（P0.05）。ELISA 实验结果显示，与 Sham 组相比，PND 组小鼠术后第 7 天海马组织匀浆液中 TNF-、IL1 水平升高（P 均0.05）。与 PND 组相比，PND+XMU-MP-1 组老龄 PND 小鼠海马组织 TNF-、IL1 的表达水平降低（P 均0.05）。结论抑制老年 PND 小鼠海马中 MST1 异常活化，可改善其认知障碍，其机制可能与下调海马区炎性因子表达有关。Hippo/MST1 激活可能是 PND 发病的重要机制之一。关键词：围术期神经认知障碍；神经炎症；Hippo 通路；MST1中图分类号：R322.81文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.04.006文章编号：1674-6309（2023）04-0362-08论著第 45 卷4 期2023 年 4 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University3624期PND 小鼠学习记忆障碍以及神经炎症的影响。1材料与方法1.1实验动物本实验所使用 SPF 级健康雄性 C57BL/6J 小鼠均来自斯贝福（北京）生物技术有限公司，14月龄，体质量 3545 g。在动物饲养过程中维持室温 25 左右，湿度 50%左右，12 h/12 h 的白天/夜间生活环境，给予足够的水和食物，定期更换饲料，保证动物生活环境干净和清洁。实验动物许可证号：SCXK（京）2019-0010。1.2药品与试剂XMU-MP1（MST1 抑制剂，批号：M00051，规格：5 mg，上海蓝木化工有限公司）；antiMST1（货号：22245-1-AP，武汉 Proteintech 公司）、antipMST1（Thr183，型号：49332，美国 CST 公司）、GAPDH（货号：10494-1-AP，武汉 Proteintech 公司）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-RabbitIgG（H+L）（货号：SA00001-2，武汉 Proteintech 公司）；小鼠肿瘤坏死因子-（TNF-）检测试剂盒、小鼠白细胞介素-1（IL-1）检测试剂盒（货号：EMC102a.96、EMC001b.96，上海欣博盛生物科技有限公司）。1.3实验方法1.3.1实验方案1）实验第一部分：验证模型的成功及术后 MST1、P-MST1 的表达。对 48 只健康雄性老龄 C57BL/6J 小鼠在实验开始前进行水迷宫定位航行训练，一方面为了使老龄小鼠学会寻找隐藏在水下的平台，另一方面为了剔除学习记忆能力异常的小鼠。每只小鼠于固定时间点重复训练 6 d，若小鼠连续 6 d 在 60 s 内不能找平台，则视为认知功能异常并剔除。选取学习记忆能力正常的小鼠随机分为假手术组（Sham 组）和手术组（PND 组），每个时间点各 6 只。Sham 组小鼠麻醉后于右侧后肢胫前皮肤仅给予切开缝合处理；PND 组小鼠在麻醉后接受胫骨骨折髓内钉固定术处理。在术前连续 6 d 对小鼠进行水迷宫定位航行训练，于第 7 天做胫骨骨折髓内钉固定手术建立 PND 模型，空间探索实验分别在术后 1、5、7、14 d 进行，各个时间点水迷宫结束后立即将动物处死，取海马组织，Western blot 检测 MST1、P-MST1 的表达。2）实验第二部分：同第一部分，实验前对 40 只健康雄性 C57BL/6J 小鼠行水迷宫定位航行训练后选取学习记忆能力正常的小鼠随机分为 Sham 组、PND 组、PND+Vehicle 组和PND+XMU-MP-1 组，每组 10 只。Sham 小鼠仅给予麻醉后切开缝合处理；PND 组小鼠在麻醉后接受胫骨骨折髓内钉固定术。根据文献10配制XMU-MP-1 溶液，其腹腔注射溶剂配方：将 XMU-MP-1溶解在纯的 DMSO 中配成母液，母液浓度为100 mg mL-1，然后按照体积比加入其他溶剂。配方：2%母 液（in DMSO）+30%PEG300+2%Tween80+66%水，工 作 液 浓 度为 2 mg mL-1。储存：母液可以分装冻存（-80），工作液现配现用。PND+XMU-MP-1 组于麻醉前半小时和苏醒后腹腔注射 XMU-MP-1 2 mg kg-1，每日 1 次，连续 7 d，PND+Vehicle 组每天腹腔注射相同体积的溶剂。各组小鼠于术后第 7 天空间探索实验结束后立即处死，提取双侧海马进行检测。1.3.2采用胫骨骨折髓内钉固定术建立小鼠PND 模型115%水合氯醛（药物用量 0.5 mL/100 g）麻醉小鼠，待小鼠失去感觉后进行手术治疗，小鼠仰卧位于手术台上，备皮，使用碘伏棉签对其右侧后肢胫前皮肤部位以及周围 1 cm 处的皮肤进行消毒，切开皮肤约 0.50 cm，分离皮下组织暴露小鼠的胫骨，取宽 0.38 mm、长 0.80 cm 的钢针插入小鼠髓腔中，用眼科剪于胫骨中下 1/3 处剪断，术后冲洗伤口并缝合。术后在切口周围局部浸润镇痛，术中注意保持小鼠在合适的体温，等小鼠苏醒良好放回笼内饲养。术后对各组老龄小鼠行水迷宫空间探索实验，提取数据分析老龄小鼠认知功能状态，其中逃避潜伏期越长、穿台次数越少、目标象限停留时间百分比越低，表示老龄小鼠学习记忆障碍越严重，则表明 PND 模型建立成功。1.3.3小鼠水迷宫行为学测定12本实验利用Morris 水迷宫实验对小鼠的空间学习、记忆等认知水平进行评估。具体内容包括：1）定位航行实验：实验前先将老龄小鼠放置在平台上停留 30 s，待其熟悉周围环境后，将小鼠头朝池壁放入水中，记录小鼠找到水下隐藏平台的时间，连续训练 6 d。剔除在规定时间内找不到水下隐藏平台的小鼠，将所有在规定时间内能找到水下平台的老龄小鼠集中，随机分为 Sham 组和 PND 组。于第 7 天做胫骨骨折髓内钉固定手术建立 PND 模型，分别于术后 1、5、7、14 d 进行空间探索实验。2）在经过连续 6 d 的训练后，老龄小鼠已形成固定的记忆，当撤除水下隐藏平台，小鼠会凭已经形成的记忆探索原来的平台，在平台所在位置停留时间会比其他任何位置多。将老年小鼠由原始平台所在位置的对侧象限头朝下放入水中，记录展巧稚，等.Hippo/MST1对老龄围术期小鼠认知功能的影响及机制363宁夏医科大学学报45卷并分析老龄小鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间百分比、穿台次数和游泳速度，作为检测空间记忆的指标。1.3.4Western blot 测定小鼠海马组织 MST1、P-MST1 表达提取海马组织，根据 BCA 法检测总蛋白含量，然后采用浓缩胶 80 V、30 min，分离胶120 V、90 min 的条件分离，在转完膜后用含 5%脱脂牛奶的封闭液封闭 2 h，将活化的 PVDF 膜与 anti-P-MST1（11 000）、anti-MST1（11 000）、antiGAPDH（14 000 稀释）在 4 下孵育过夜，之后加 HRP 偶联二抗（12 000）在室温下孵育1 h。采用超敏 ECL 发光液进行显影，采用 Image J软件计算 P-MST1 的相对蛋白表达水平（P-MST1/MST1），用 GraphPad 绘制柱状图。1.3.5ELISA 检测小鼠海马组织 IL-1、TNF-水平根据试剂盒说明书，将海马样品制备成组织匀浆，离心（10 000 r min-1，15 min）后去除悬浮物，收集上清液用 ELISA 法检测海马组织 IL-1、TNF-的表达。使用 96 孔板在 450 nm 处测量吸光度，将所有用标准品和样品的吸光值减去对照值后建立坐标和方程，计算出的浓度乘以稀释倍数为最终浓度。用该浓度除以蛋白浓度即得到最终结果（以 pg mg-1pr