发酵植物蛋白复配替代豆粕对...抗氧化及肠道菌群结构的影响_陈倪慧.pdf

动物营养学报，（）：发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼生长、免疫、抗氧化及肠道菌群结构的影响陈倪慧 杨 霞 孙珊珊 雷西汀 邵仙萍 吴成龙 叶金云（湖州师范学院生命科学学院，水生动物繁殖与营养国家地方联合工程实验室，浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室，湖州）摘 要：本试验研究发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼生长、免疫、抗氧化及肠道菌群结构的影响。以不同比例（和）发酵棉籽粕和发酵菜籽粕分别替代基础饲料中（对照组）、的豆粕，配制 种等氮等能试验饲料，饲喂初始体重（）的青鱼，试验期 周。结果显示：各组之间生长性能、形体指标及体组成均无显著差异（）。各组之间血清补体、丙二醛、白蛋白含量以及溶菌酶活性均无显著差异（）。替代组的血清补体 含量均显著高于其他各组（），替代组的血清免疫球蛋白 含量均显著高于对照组（）。各组之间肝胰腺超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶活性和总抗氧化能力以及总胆固醇含量均无显著差异（）。各组之间肠道 淀粉酶和脂肪酶活性无显著差异（），发酵棉籽粕和发酵菜籽粕以 比例替代 豆粕组的肠道胃蛋白酶活性显著高于对照组（）。在门水平上，青鱼肠道微生物优势菌门为变形菌门（）、厚壁菌门（）、梭杆菌门（）和浮霉菌门（）；在属水平上，青鱼肠道微生物优势菌属为气单胞菌属（）、鲸杆菌属（）、青枯菌属（）和邻单胞菌属（）。各组之间肠道主要菌群的相对丰度均无显著差异（）。综上所述，本试验条件下，高比例（）发酵植物蛋白替代豆粕没有造成青鱼肝胰腺的损伤以及肠道菌群结构的改变，甚至提高了血清部分免疫指标活性及肠道胃蛋白酶活性，且发酵棉籽粕和发酵菜籽粕的复配比例也不会对青鱼生长性能、形体指标、体组成、肝胰腺抗氧化指标和肠道菌群结构产生显著影响。关键词：青鱼；发酵植物蛋白；豆粕；免疫；肠道菌群中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家现代农业产业技术体系资助（）；浙江省公益技术研究计划（）；湖州市公益性应用研究项目（）作者简介：陈倪慧（），女，江苏兴化人，硕士研究生，研究方向为水产动物营养与饲料。：通信作者：杨 霞，副教授，硕士生导师，：；叶金云，研究员，博士生导师，：豆粕作为我国主要的植物蛋白质饲用原料，在水产和畜禽饲料中应用广泛。长期以来，鱼粉资源短缺，导致豆粕供求关系紧张，价格波动不规律，限制了其在水产饲料中的广泛应用，其他植物蛋白质饲用原料（如棉籽粕、菜籽粕、花生粕、葵仁粕等）的使用量因此逐渐提高。其中，棉籽粕和菜籽粕蛋白质含量较高，来源广泛，但抗营养因子水平高、适口性差等因素制约了二者在水产类饲料中的广泛应用。棉籽粕中的抗营养因子不仅会对养殖对象的消化道造成损伤，还会导致低血钾以及影响其繁殖性能。菜籽粕中抗营养因子，如硫代葡萄糖苷、芥酸、植酸、单宁等，会造成水产动物免疫力下降，肝脏组织受损等。而经过微生物发酵的棉籽粕和菜籽粕，其抗营养因子水平大 期陈倪慧等：发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼生长、免疫、抗氧化及肠道菌群结构的影响大降低，蛋白质含量增加，且所含的大分子蛋白质被分解成小肽，具有良好的应用前景。一些学者已 在 草 鱼（）、鲫 鱼（）等水产动物上进行了关于发酵棉籽粕（，）替代豆粕的研究，还有以尼罗罗非鱼（）、红鲷（）等为养殖对象的有关发酵菜籽粕（，）在饲料中的应用研究。青鱼（）是我国传统的淡水养殖鱼类，具有较高的营养及药用价值，深受消费者的喜爱。目前，发酵植物蛋白质替代豆粕在青鱼饲料中的应用研究鲜有报道。有研究表明，食物中蛋白质来源和含量对宿主肠道微生物菌群的组成、代谢过程以及代谢产物有显著影响。动物肠道菌群能够预防病原体定植，具有调节宿主新陈代谢、免疫系统以及营养吸收的能力。基于此，本试验旨在研究饲料中 和 不同复配比例替代豆粕对青鱼生长性能、形体指标、体组成、血清免疫指标、肝胰腺抗氧化指标、肠道消化酶活性以及肠道菌群结构的影响，以期为发酵植物蛋白质源在青鱼配合饲料中的应用提供理论基础。材料与方法 试验设计和饲料 选择平均体重为（）的健康青鱼 尾，随机分为 组，每组 个重复，每个重复 尾。以进口鱼粉、豆粕、玉米蛋白粉和花生粕为主要蛋白质源，鱼油为主要脂肪源，配制 组等氮等脂的试验饲料。组（对照组）试验饲料中未添加 和，组试验饲料中以 和（）替代 的豆粕，组试验饲料中以 和（）替代 的豆粕，组试验饲料中以 和（）替代 的豆粕，组试验饲料中以 和（）替代 的豆粕。试验饲料组成及营养水平见表。原料经粉碎机粉碎，过 目筛，按饲料配方进行称重混匀，然后添加脂肪源混合均匀，再加水混合至适合湿度且无颗粒感，最后用螺杆压条机制成粒径为 的颗粒料，至烘箱低温烘干至水分小于 后，保存于 的冰柜中备用。表 试验饲料组成及营养水平（风干基础）（）项目组别 原料 鱼粉 （）豆粕 （）花生粕 （）玉米蛋白粉 （）发酵菜籽粕 ）发酵棉籽粕 ）木薯淀粉 鱼油 大豆卵磷脂 磷酸二氢钙（）氯化胆碱 预混料）粘合剂 合计 营养水平 ）干物质 粗蛋白质 动 物 营 养 学 报 卷续表 项目组别 粗脂肪 粗灰分 ）发酵棉籽粕营养水平 ：干物质 ，粗蛋白质 ，粗脂肪，粗灰分 ，酸溶蛋白 。）发酵菜籽粕营养水平 ：干物质 ，粗蛋白质 ，粗脂肪，粗灰分 ，酸溶蛋白 。）预混料为每千克饲料提供 ：，沸石粉 ，硫胺素 ，核黄素 ，泛酸 ，吡哆醇 ，叶酸 ，尼克酸 ，肌醇 。）计算值 。饲养管理 养殖试验在湖州师范学院水生生物养殖实验中心内进行，试验所用青鱼鱼苗购于湖州当地某苗种培育场。正式养殖试验前，进行周期为 的暂养，暂养期均使用基础饲料。暂养结束后，选出平均体重为（）的健康青鱼，随机分配到养殖中心水泥池（长宽高 ）的网箱（长宽高 ）中，每组 个重复（网箱），每个网箱投放 尾青鱼。正式试验开始前禁食 ，正式养殖期间每天投喂 次（：、：），采用饱食投喂的方法。养殖期间每日 不间断曝气充氧，每日吸污，根据养殖水体情况进行换水，换水量约为水泥池高度的。养殖试验期间，自然光照，水温（），水体溶氧浓度 ，。试验期 周。样品采集与指标分析 样品采集 养殖结束后，禁食 ，对每个网箱中的青鱼进行计数并称重，分别计算增重率（，）、特 定 生 长 率（，）、成活率（，）；随机取 尾鱼用于全鱼体组成分析，再取若干尾进行解剖用于肝体比（，）、脏体比（，）分析。试验鱼经 麻醉后，使用 针剂器进行尾静脉采血，血样于 中静置过夜后，、离心 ，取上层血清备用，用于血清免疫指标检测。鱼体采血后迅速剖开腹腔，取肝胰腺用于抗氧化指标检测，取肠道用于消化酶活性和肠道菌群检测，取背肌用于化学成分检测，全部样品 储存。生长和形体指标的测定 生长指标计算公式如下：成活率（）终末尾数 初始尾数；增重率（）（终末体重初始体重）初始体重；特定生长率（）（终末体重 初始体重）养殖天数。形体指标计算公式如下：肝体比（）肝胰腺重 终末体重；脏体比（）内脏团重 终末体重。体组成测定 青鱼全鱼和肌肉水分含量采用 干燥法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法测定，粗灰分含量采用马弗炉灼烧法测定。血清免疫指标、肝胰腺抗氧化指标和肠道消化酶活性测定 血清免疫指标包括补体（）、补体（）、免疫球蛋白（）、丙二醛（）、溶菌酶（）和白蛋白（）；肝胰腺抗氧化指标包括总抗氧化能力（）、过氧化氢酶（）、碱性磷酸酶（）、超氧化物歧酶（）和总胆固醇（）；肠道消化酶为 淀粉酶（）、胃蛋白酶（）和脂肪酶（）。以上指标均采用试剂盒购进行检测，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。期陈倪慧等：发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼生长、免疫、抗氧化及肠道菌群结构的影响 肠道菌群结构测定 将采集的肠道及其内容物（每组 个平行）送至广州基迪奥科技服务有限公司进行样品 提取、建库和 扩增子高通量测序。具体流程参照吴金平等的方法，进行物种注释分析的数据库为 、和。测定结果已上传至，登录号为。数据统计分析 采用 软件对所得数据进行单因素方差分析（），若差异达到显著水平，则进行 氏多重比较。结果采用平均值标准误表示，表示差异显著。结果与分析发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼生长性能及形体指标的影响 由表 可见，各组之间青鱼生长性能及形体指标均无显著差异（）。其中，组的成活率最低，组的成活率最高；、和 组增重率分别比 组增加了、；、和 组的肝体比和脏体比均低于 组。表 发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼生长性能及形体指标的影响 组别初始体重 终末体重 特定生长率（）增重率 肝体比 脏体比 成活率 同列数据肩标无字母表示差异不显著（）。表 同。，（）发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼全鱼和肌肉组成的影响由表可见，各组之间青鱼全鱼和肌肉的水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量均无显著差异（）。表 发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼全鱼和肌肉组成的影响（湿重基础）（）项目组别 全鱼 水分 粗蛋白质 粗脂肪 粗灰分 肌肉 水分 粗蛋白质 粗脂肪 粗灰分 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（），相同或无字母表示差异不显著（）。表 和表 同。，（），（）动 物 营 养 学 报 卷 发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼血清免疫指标的影响 由表 可见，各组之间青鱼血清、含 量 以 及 活 性 均 无 显 著 差 异（）。与 组相比，和 组血清 含量显著提高（），和 组血清 含量无显著差异（）；和 组血清 含量显著提高（），和 组血清 含量无显著差异（）。和 组之间、和 组之间血清、含量均无显著差异（）。表 发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼血清免疫指标的影响 项目组别 免疫球蛋白 （）补体 （）补体 （）丙二醛 （）溶菌酶 （）白蛋白 （）发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼肝胰腺抗氧化指标的影响由 表 可 见，各 组 之 间 青 鱼 肝 胰 腺 、活性和 含量及 均无显著差异（）。表 发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼肝胰腺抗氧化指标的影响 项目组别 总抗氧化能力 （）过氧化氢酶 （）超氧化物歧化酶 （）碱性磷酸酶 （）总胆固醇 （）发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼肠道消化酶活性的影响 由图 可见，各组之间青鱼的肠道 和 活性均无显著差异（）。与 组相比，组的肠道 活性显著提高（），、和 组的肠道 活性无显著差异（）。发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼肠道菌群结构的影响 根据 距离，用主坐标分析（）图显示发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼肠道菌群组成模式的影响。由图 可见，在主成分 水平上，组和 组与 组的菌群组成模式存在一定的差异。由图 可见，在门水平下，、和 组肠道变形菌门相对丰度分别为、和，肠道厚壁 菌 门 相 对 丰 度 分 别 为 、和，肠道梭杆菌门相对丰度分别为、和，肠道浮霉菌门相对丰度分别为、。变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和浮霉菌门为青鱼肠道菌群中相对丰度排行前 的菌门，是青鱼肠道中的核心菌群。期陈倪慧等：发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼生长、免疫、抗氧化及肠道菌群结构的影响 数据柱标不同小写字母表示差异显著（），相同或无字母表示差异不显著（）。（），（）图 发酵植物蛋白复配替代豆粕对青鱼肠道消化酶活性的影响 图 青鱼肠道菌群的主坐标分析 由表 可见，所有组别的覆盖率均在 以上，说明各试验组的微生物种类均已检测到。各组操作分类单元（）数量无显著差异（）。各组之间肠道菌群 指数、指数、指数和 指数均无显著差异（）。其中，指数、指数均为 组最低，组最高；指数以 组最高，组最低；指数以 组最高，组最低。表 发酵植物蛋白对青鱼肠道菌群 多样性的影响 组别操作分类单元 个 指数 指数 指数 指数 覆盖率 在门、纲、目、科、属、种水平下，对各组青鱼肠道主要菌群进行常规方差分析，结果见表。由表可知，各组之间主要菌群相对比较稳定，但组间差异较大导致标准差偏大的情况也存在。在门水平下，主要为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、浮霉菌门、拟杆菌门；在纲水平下，主要为 变形菌纲、浮霉菌纲；在目水平下，主要为气单胞菌目；在科水平下，主要为气单胞菌科；在属水平下，主要为气单胞菌属、鲸杆菌属、青枯菌属、邻单胞菌属；在种水平下，主要为维氏气单胞菌。各组之间青鱼肠道主要菌群的相对丰度均无显著差异（）。讨 论发酵植物