二维液相色谱法测定婴幼儿配...和4种维生素E异构体的含量_林洋.pdf

280 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-09-30 作者简介：林洋(1988)，女，硕士，工程师，研究方向为食品质量检测。林 洋，张宏宏，周长民，刘 瀛，许文雅(沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110122)摘要：应用在线中心切割双梯度双检测器液相色谱系统，建立二维液相色谱法同时测定婴幼儿配方食品中维生素A、D3和4种维生素E异构体含量的方法。一维分析系统选择PEP柱，以甲醇-水体系作为流动相，完成VA、-VE、-VE、-VE、-VE的分离定量和VD3的净化，经捕获柱捕集VD3馏分转到二维色谱柱中；二维分析系统选择PAH柱，以甲醇-乙腈体系作为流动相，完成VD3的定量分析。VA在1.010 mg/L、VD3在0.10.8 mg/L、VE在2.550 mg/L浓度范围内相关系数均大于0.999；平均回收率为90.5%102.4%；相对标准偏差RSD(n=6)为1.6%4.5%，该方法对实际样品的检测结果与国标法的测定结果相对差异均小于10%，且VD3的测定稳定性优于标准方法。该方法可同时快速、准确测定婴幼儿配方食品中VA、VD3、VE的含量，提高样品分析效率。关键词：二维液相；维生素A；维生素D3；维生素E；婴幼儿配方食品中图分类号：TS 207.3；O 657.7+2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0280-05Determination of Vitamin A,D3 and Four Vitamin E Isomers in Infant Formula Food by Two-Dimensional Liquid ChromatographyLIN Yang,ZHANG Honghong,ZHOU Changmin,LIU Ying,XU Wenya(Shenyang Institute for Food and Drug Control,Shenyang 110122,China)Abstract:A method for simultaneous determination of vitamin A,D3 and four vitamin E isomers in infant formula by two-dimensional liquid chromatography was established by using an online heart-cutting dual-gradient dual-detector liquid chromatography system.The one-dimensional analysis system selects PEP column and uses methanol-water system as the mobile phase to complete the separation and quantification of VA,-VE,-VE,-VE,-VE and purification of VD3,and the VD3 fraction is captured by the trapping column and transferred to the two-dimensional chromatographic column.The two-dimensional analysis system selects the PAH column,and uses the methanol-acetonitrile system as the mobile phase to complete the quantitative analysis of VD3.The correlation coefficients of VA in the concentration range of 1.010 mg/L,VD3 in the range of 0.10.8 mg/L,and VE in the concentration range of 2.550 mg/L were all greater than 0.999;the average recovery rate is 90.5%102.4%;the relative standard 二维液相色谱法测定婴幼儿配方食品中维生素A、D3和4种维生素E异构体的含量DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.041 281 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期0 引言维生素是人体生长发育和生理代谢所必需的一类微量活性物质。根据国家标准中婴幼儿配方食品营养成分1-4有关规定，必须强化的维生素分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类，其中脂溶性维生素包括VA(视黄醇)、VD3(胆钙化醇)、VE(生育酚)等。VA、VD3、VE对维持机体正常的视觉功能、促进机体骨骼和牙齿发育、调节细胞代谢及促进性腺发育等具有重要作用5-6。目前，关于婴幼儿配方食品中VA、VD3和VE的测定方法的报道较多，有荧光法、分光光度法、高效液相色谱法和高效液相色谱质谱串联法等7-9。现行国家标准液相色谱方法10采用正相半制备和反相分析两套色谱仪器进行净化和分析，分析效率低且回收率不稳定，无法同时检测VD3与VA、VE。随着多维分离技术的发展，二维液相色谱能够扩大分离空间，增加峰容量，提高色谱系统的分离能力，这也是复杂样品制备和测定的发展趋势11-15。现有二维色谱法操作连接较为复杂，且大多只测定VE 4种异构体中-生育酚一种形式，本方法拟通过在线中心切割二维柱切换高效液相色谱分离系统，选用PEP柱，建立一次进样同时完成VA、VD3及VE 4种异构体共6种化合物的分析测定方法，提高了测定的准确性和样品分析效率，为婴幼儿配方食品中VA、VD3和VE的检测提供技术参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器甲醇、乙腈：色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；淀粉酶；氢氧化钾、抗坏血酸、BHT、无水硫酸钠、石油醚、无水乙醚、无水乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水：一级水；维生素A(纯度98.6%)、-生育酚(纯度96.8%)、-生育酚(纯度95%)：Sigma公司；维生素D3：中国食品药品检定研究院，纯度99.9%；-生育酚(纯度96%)、-生育酚(纯度96%)：TRC公司；婴幼儿配方乳粉、特殊医用婴幼儿配方食品、婴幼儿米粉、婴幼儿面条：市售。Agilent 1260二维液相色谱仪：Agilent公司；涡旋混合器：德国IKA公司；旋转蒸发仪：EYELA公司；M64平行浓缩仪：莱伯泰科公司；DKZ-2电热恒温振荡水槽：上海一恒科技有限公司；JJ600电子天平：常熟双杰公司；Millipore纯水机：SAS公司；移液器：普兰德公司。1.2 实验方法1.2.1 标准溶液的配制 分别称取适量VA、VD3和-VE、-VE、-VE、-VE标准品，用无水乙醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，配制成质量浓度均为100 mg/L的标准储备液。取上述标准储备液适量，用甲醇稀释配制成标准工作液。1.2.2 样品的前处理 称取5 g样品于三角瓶中，用20 mL温水溶解，含淀粉的样品加入0.51 g淀粉酶，60 水浴避光恒温振荡30 min后，加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT混匀，加入30 mL无水乙醇，20 mL氢氧化钾溶液混匀，60 恒温水浴振荡皂化60 min，皂化后立即冷却至室温。用少量水将皂化液转入分液漏斗中，加入50 mL石油醚-无水乙醚混合液，振荡萃取10 min，将下层溶液转移至另一分液漏斗中，重复萃取后合并醚层，用水洗涤醚层直至中性。将醚液通过无水硫酸钠除水，收入圆底烧瓶，旋转蒸发至近干。残渣用甲醇转移至10 mL容量瓶中并定容。1.2.3 色谱条件 一维色谱柱：Agilent Poroshell 120 PFP(4.6 mm100 mm，2.7 m)；二维色谱柱：Zorbax Eclipse Plus PAH(2.1 mm100 mm，3.5 m)；捕获柱：Poroshell 120 EC C18(4.6 mm5 mm，4 m)；VA、VD3、VE检测波长分别为325、264、294 nm；进样量为10 L，柱温为35。一维分析泵流动相A为水，B为甲醇，流速为0.8 mL/min；二维分析泵的流动相A为甲醇，B为乙腈，流速为0.3 mL/min，具体梯度洗脱程序见deviation RSD(n=6)is 1.6%4.5%,the relative difference between the test results of the actual sample and the national standard method by this method is less than 10%,and the determination stability of VD3 is better than standard method.The method can simultaneously rapidly and accurately determine the contents of VA,VD3 and VE in infant formula food,and improve the efficiency of sample analysis.Key words:two-dimensional liquid phase;vitamin A;vitamin D3;vitamin E;infant formula 282 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期表1。表1 一维、二维系统的洗脱程序一维分析系统二维分析系统时间/minA/%B/%时间/minA/%B/%0.017830.00.010010.00.01005.90.010011.00.01006.0307011.1178310.0307015.0178310.10.010015.00.01002 结果分析2.1 系统流路的构建和阀切换时间的确定在婴幼儿配方食品中VA含量为2401200 g/100 g，VD3含量为3.020 g/100 g，VE含量为2.025 mg/100 g16。由于婴幼儿配方食品基质较为复杂，且VD3含量较VA和VE相差2个数量级以上，很难同时定量测定，本实验通过六通阀在线柱切换使得VD3馏分在捕获柱中收集洗脱，达到净化的效果，以实现短时间内分析VA、VD和VE的目的。为整个系统的分析始终处于动态平衡，保证样品的连续进样和及时分析，首先要确定阀切换时间，将一维色谱柱直接与检测器连接进样3次确定VD3保留时间，再通过观察峰宽来设置阀切换的时间范围，切割的时间窗太窄容易造成目标物的损失，太宽会使切换到二维分离柱的溶剂体积过大，产生溶剂效应17。当VD3在一维液相色谱柱中保留时间为6.25 min，峰宽约为0.2 min时，以阀切换的开始时间为峰起点时间减去0.1 min，阀切换的结束时间为峰终点时间加上0.1 min，即阀切换的时间为6.05 min，阀切回的时间为6.45 min。具体连接方法及切换过程如下，第一阶段：进样，第一维开始分析VA，此时阀位置在“12”，捕获柱与二维色谱柱串联在第二维流路中进行冲洗，VA经过第一维色谱柱后直接进入第一维检测器检测，见图1；第二阶段：在第一维VD3开始出峰的时间点前0.1 min将阀切换至“16”，此时捕获柱从第二维切换到第一维流路，与一维色谱柱串联，VD3馏分被捕集到捕获柱上，见图2；第三阶段：在第一维VD3出峰结束的时间再将阀切回“12”，此时捕获柱从第一维回到第二维流路，VD3被第二维流动相反向洗脱