病原微生物检测技术方法研究进展_尹伟.pdf

汕头大学学报（自然科学版）第 38 卷2023 年 05 月汕头大学学报（自然科学版）第 38 卷 第 2 期May2023Journal of Shantou University(Natural Science)Vol.38 No.2文章编号：1001-4217（2023）02-0040-09病原微生物检测技术方法研究进展尹伟1，2，3，胡琪2，李新章2，张爽3，范高福1（1.合肥职业技术学院 生物工程学院，安徽合肥238000；2.南通睿沣新材料技术有限公司 化学成分分析中心，江苏南通226000；3.中国科学技术大学高分子科学与工程系 中科院软物质化学重点实验室，安徽合肥230026）摘要病原微生物作为自然界中对人畜都能引起致病性的一类微小生物体，对人类健康造成了巨大威胁，极容易引起在全球范围内的大流行，能够快速、精准、高效的检测出病原微生物，是摆在广大医学工作者面前亟待解决的课题.本文从免疫学检测技术、分子生物学检测技术及病原微生物代谢学检测技术三大方面综述了病原微生物的检测方法，旨在为能够快速、有效的检测出病原微生物提供参考.关键词病原微生物；免疫学；分子生物学；检测技术；研究进展中图分类号R914.5文献标识码A微生物在自然界中广泛分布，属于形体微小、种类及数量繁多的一类低等生物体，其中，对人和动物能够产生致病性的一类微生物，称为病原微生物.近年来，由病原微生物引起的疾病，如禽流感（H7N9）、非典型肺炎（SARS）以及目前仍在全球肆虐的新型冠状病毒（2019-nCoV）等所感染的疾病，传染性都极强，通常能够造成世界性的大流行1-4，因此在对病原微生物的检测方面，务必要做到精准、快速、高效和简便.有效的病原微生物检测方法，能够在很大程度上提高检测的时效性、精准性，在医学、食品等领域发挥重要作用.本文对病原微生物的不同检测技术进行了概括总结，同时对不同检测技术进行了分析对比，以期为进一步开发新的病原微生物检测技术奠定基础.1病原微生物免疫学检测技术病原微生物的免疫学的检测技术，主要是通过抗原与抗体的相关反应，将食品、药品以及传染病中涉及到的病原微生物检测出来.收稿日期：2022-08-21作者简介：尹伟（1983），男（汉族），安徽合肥人，教授，博士，研究方向：微生物检测、化工中间体合成研究.E-mail：基金项目：安徽省高校自然科学研究项目（KJ2021ZD0158，KJ2021ZD0159）；安徽省高校优秀青年人才支持计划重点项目（gxyqZD2022124）；安徽省教育厅质量工程项目（2020zyk33）第 2 期1.1酶联免疫吸附检测技术（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）酶联免疫吸附测定法（ELISA），是通过将抗原或者抗体吸附在相关载体上，同时用一些酶对其标记，与吸附在载体上的抗原或者抗体进行结合，形成一些免疫复合物，与此同时，分析被酶分解的相关底物颜色信号的改变，对其实现定量或定性分析5-7.ELISA 检测具有时间短、特异性高以及灵敏度非常强等优点，当然，亦伴随一些重复性较差、检测过程较为繁杂等弊端8-11.近年来，通过特殊的光电磁等新型材料的问世，对新型 ELISA 检测技术的开发带来了机遇.基于新型材料的改良的 ELISA 中，Jiang 等人通过构建辣根过氧化物酶介导的反应，从而调节聚合物 AuNPs 的聚集状态12.通过图 1 可以看出，通过过氧化物的调节，对碘化物进行氧化，生成相应的碘单质，诱导金纳米粒子的聚集，颜色由红色转变为蓝色.基于新型荧光纳米材料的改变，有研究提出了荧光免疫的设计，进而开发了改进型ELISA 及荧光免疫测定法（FELISA）.XU 等13研究开发了通过 CAT 调节的荧光转换方法，用于测定伏马毒素 B1（FB1），如图 2 所示，通过 H2O2对巯基丙酸介导 CdTe 的荧光点进行淬灭，在检测中，通过调节 H2O2的浓度，进行对被测物进行检测14.此外，基于电化学免疫分析、光热效应、表面增强拉曼散射、化学发光免疫分析等设计的 ELISA 测定方法，在病原微生物检测上得到了非常广泛的应用，同时由于这些方法的简便、灵活，且能够用于痕量检测等优点，展现出了非常大的应用前景.1.2免疫磁珠分离技术（IMBS）免疫磁珠分离技术，是通过以免疫学为基础，结合活性蛋白质，且被磁铁吸引，从而将抗体与磁铁结合，使得磁铁成为相应载体，进而形成抗原-抗体-磁珠复合物，形成的复合物在外在磁力的作用下，产生力学变化，达到与其它物质分离，能够特异性的分离抗原的方法15.此方法现已经涉及到微生物、生化、药理以及病例等各个领域，在免疫学检测及生物学检测等方面应用广泛16-17.图 1 基于辣根过氧化物酶介导 AuNPs 的 ELISA 图尹伟等：病原微生物检测技术方法研究进展41汕头大学学报（自然科学版）第 38 卷有研究显示18，通过使用 IMBS 分离技术能够有效检测出猪肉中的志贺氏菌等病原微生物.亦有报道利用 IMBS 分离技术，从污染菌的试样中，富集了李斯特菌19.现在关于免疫磁珠分离技术能够与多种微生物检测技术结合，能够有效实现对食源性病原微生物的快捷、高灵敏度的检测20.IMSB 结合 PCR 技术、电化学技术以及培养基分离技术等，实现了高效、精准等特点的高通量筛选，且能够实现在 4 h 以内，快速确定病原微生物的检测21-23，特别是在布氏杆菌、大肠杆菌的检测上效果较好.免疫磁珠分离技术在微生物等领域得到有效应用的同时，亦有一定的不足之处，在操作过程中涉及到阳性分选法及阴性分选法，在阳性分选法中，需要对特异性的靶细胞进行标记，可能引起细胞活化，在阴性分选法时，会需要多种抗体来标记不需要的细胞.2病原微生物分子生物学检测技术近年来，分子生物相关检测技术在病原微生物检测上的应用突飞猛进，在很大程度上解决了病原微生物检测时限长、精准性不高等问题，为病原微生物检测技术的发展指引了研究方向.2.1聚合酶链式反应检测技术（PCR）聚合酶链式反应是一种扩增 DNA 片段的特殊技术，可以看成是一种特殊的分子生物技术中的 DNA 复制技术，能够将微量的 DNA 片段大幅度增加.PCR 反应的特点主要表现在特异性强、灵敏度高以及简便快速等方面.同时，PCR 技术在病原微生物的检测领域应用也非常广泛.有研究显示24，利用多重 PCR 扩增技术，对在低温储存的肉类食品进行了病原微生物的检测.亦有实验表明25，在检测虾米中沙门氏菌的实验中，PCR检测技术，比传统的检测技术所用的时间大大降低.Agarwal A 等26-27通过 PCR 方法检测图 2 ELISA 对 FB1 的检测示意图42第 2 期出了食品中的致病微生物沙门氏菌.同样，Kim J 等28-29通过多重 PCR 方法，检测小麦中的病原微生物的污染情况，发现了鼠伤寒沙门氏菌以及大肠杆菌等，此方法具有很高的特异性，且对难以辨别的病原微生物具有较好的识别，当然 PCR 检测方法亦有一定的局限性，如只能检测微生物的存在，在微生物产生的毒素检测方面效果较差，同时会出现假阳性或者假阴性结果.2.2核酸探针检测技术核酸探针技术主要是通过核苷酸碱基对互补的原理，用特异的基因探针对不同碱基对，进行特异性的识别，从而检测被测序列.核酸检测探针，一般主要分为传统及功能化的核酸探针，传统核酸检测探针主要包括克隆探针等30，而功能化的探针包括核酶及核酸适配体等.核酸检测技术在病原体检测的应用上起到了非常重要的作用.构建双标荧光团适配体核酸探针，能够更好的提高定量检测限.有研究提出了一种基于核酸适配子的赭曲霉毒素 A 荧光生物传感器的检测方法.它由核糖核酸酶 H 辅助的循环反应导致信号的显著放大，这使得检测下限为 0.08 ng/mL.利用该技术发现赭曲霉毒素 A 对赭曲霉毒素 B 和黄曲霉毒素 B1 具有较高的选择性.在实际样品中使用不同浓度的赭曲霉毒素 A 对红酒样品进行了定量验证，回收率范围为 96.1%107.5%.该核酸适配子在食品工业中具有重要的实际应用价值，并且可以通过替代识别核酸适配子的序列，将其扩展到其他毒素的检测中31.Zhu 等人构建了基于单壁碳纳米管（SWCNTs）的适配体检测探针，利用单壁碳纳米管的过氧化物酶样活性和非特异性 DNA 序列对这种活性的影响，通过将 3 种 DNA 序列（mDNA）进行修饰，构建了一种比色探针，最终，我们实现了 12 例临床肿瘤患者溶解血液中循环肿瘤细胞的精确定量，具有良好的临床应用前景32.2.3基因芯片检测技术生物芯片又称基因芯片，是通过微加工技术，将数以万计一定序列的 DNA 片段固定在硅片的表面，形成规律性的 DNA 探针序列，基因芯片能够对不同序列的微生物样品进行检测，在病原微生物领域有着非常广泛的应用.有研究显示33，通过基因芯片技术对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌等进行检测，在短时间（8 h）内，就能够得到精准的检测结果.亦有研究报道34，将奇异变形杆菌及大肠埃希菌等，同时进行基因芯片检测，在极低的检测浓度下，亦能进行有效的检测.生物基因芯片检测技术是一种微量分析技术，具有重复性好、精准、快速等特点，在临床研究中亦有很好的应用35.3病原微生物代谢学检测技术3.1三磷酸腺苷（ATP）生物发光技术ATP 生物发光检测法，主要是通过 ATP 与荧光素酶复合物结合，用来测定食品、医药等中的微生物的总数.由于每种微生物细胞中的 ATP 的具体含量值是一定的，所以尹伟等：病原微生物检测技术方法研究进展43汕头大学学报（自然科学版）第 38 卷供试样品中的 ATP 含量与微生物的数量呈正比，这种测定技术能够在 15 s 内测定出结果，灵敏度极高.有研究报道36，将果蔬切成片状，制作成供试品的菌液体，检测试样中的 ATP 的含量，进而换算出细菌数量，间接性的测定果蔬中有无病原微生物.若供试样品中含有很多非细胞性的 ATP 时，此检测方法的应用范围可能受到较大程度的限制37.一般来说，ATP 发光技术检测微生物，可实现精准、稳定、快速检测微生物总数的需求，但设备比较昂贵，对仪器的清洗保养要求特别高.检测时需要预处理，去除胞外游离的 ATP.3.2电阻抗技术电阻抗技术病原微生物检测的应用中，主要是对应蛋白质、脂肪以及碳水化合物的含量进行测量，通过将大分子物质代谢转变成小分子，提高检测培养基的导电性变化，改变电阻大小，进而测定其中有无微生物存在，通过此技术能够有效测定样品中的病原微生物的数量，在测定酵母菌、霉菌以及沙门氏菌方面得到了很好的应用38-40.此方法与传统的测定方法相比，具有时间短、特异性强以及重现性好等特点41-42.有研究通过对电阻抗方法与传统的检测方法进行比较，实验结果发现，电阻抗方法共检测出 119 种病原微生物，而传统的方法仅仅检测出 92 种病原微生物.当然，电阻抗技术的应用还有一些缺陷.主要是其不能在污染的标本中，把可能存在的病原菌同污染菌加以区别，同时不能用于较少菌数的检测，而且样品中不能使用防腐剂，且其在制作标准曲线的过程中工作量较大43.3.3放射测量技术放射测量技术的病原微生物检测原理，主要是通过微生物在生长繁殖的过程中，代谢产生二氧化碳.通过碳水化合物，把放射性的14C 标记原子引入其中，在病原微生物代谢时，产生放射性的二氧化碳，接着通过测量14C 标记的二氧化碳的量，间接的判定病原微生物的数量，放射量与菌数成正比，此测定方法具有时效性高、精准度高等优点44.有研究报道45，通过放射量技术对食品中的微生物进行检测.一般来说，放射量检测技术，对操作人员的要求较高，因在其应用过程中，使用了放射性的物质，使用上受到了较大限制，目前在大肠杆菌、酵母菌的检测项目中应用较多.4展望良好的病原微生物检测方法，能够在很大程度上提高检测的高效性，在流行病学等领域发挥重要作用.目前针对仍在全球范围内大流行的新型冠状病毒的有效检测，就显得尤为重要，其检测方法主要包括核酸检测（全基因测序技术、聚合酶链式反应、等温扩增技术等）、免疫检测（血清学检测、ELIS