2种方法检测乳粉中三聚氰胺的探讨及改进_刘超.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 4 期 142 研究探讨2种方法检测乳粉中三聚氰胺的探讨及改进刘超，景赞，吕雪梅乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）摘要根据GB/T 223882008第一法高效液相色谱法和第二法液相色谱-质谱/质谱法测定乳粉中三聚氰胺,乳粉经三氯乙酸和乙腈提取,阳离子交换固相萃取柱净化之后,经高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法测定,外标法定量。第一法存在操作步骤不完善,回收率较低的问题;第二法存在基质干扰,虽然采用基质空白配制标准工作液,但无法彻底消除基质效应,回收率较低。通过加标回收试验,探讨2种方法的不足,并分别提出2种方法的改进措施。关键词高效液相色谱法;液相色谱-质谱/质谱法;探讨及改进Discussion and Improvement of Two Methods for the Determination of Melamine in Milk PowderLIU Chao,JING Zan,L XuemeiLeshan Institute for Food and Drug Control(Leshan 614000)Abstract According to the GB/T 223882008,melamine in milk powder was determined by the first method of high performance liquid chromatography and the second method of LC-MS/MS.The milk powder was extracted by trichloroacetic acid and acetonitrile,purified by cation exchange solid phase extraction column,determined by liquid chromatography and LC-MS/MS,and quantified by external standard method.The first method had imperfect operation steps and low recovery rate;The second method had matrix interference.Although the standard working solution was prepared by matrix blank,it could not completely eliminate the matrix effect,and the recovery rate was low.Through the standard recovery test,the shortcomings of the two methods were discussed,and the improvement measures of the two methods were put forward respectively.Keywords HPLC;LC-MS/MS;discussion and improvement基金项目：乐山市科技局重点研究项目，22SZD007三聚氰胺，又称为密胺或蛋白精，分子式C3N3H6，含氮量达66.67%1，是一种白色晶体，熔点为354，在水、乙二醇和甘油中基本不溶解，微溶于乙醇2。三聚氰胺是一种化工原料，在乳粉中限值为2.5 mg/kg。经典的凯氏定氮法原理是检测乳粉中的含氮量，进而换算出乳粉中的蛋白质。这种方法存在漏洞，一些不法商家利用氮与蛋白质的这种含量关系，将三聚氰胺人为掺进乳粉，从而造成乳粉中蛋白质含量高的假象。过量摄入三聚氰胺导致肾脏内形成不溶性结晶，导致婴儿的肾功能衰竭甚至死亡。因此检测乳粉中三聚氰胺很有必要3。检测三聚氰胺的方法很多，高效液相色谱（HPLC）法4-6、液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）法7-11、气相色谱-质谱联用（GC-MS/MS）法均适合乳粉中三聚氰胺含量的测定。其中，HPLC法是测定三聚氰胺较为常用的方法，一般与紫外检测器和二级管阵列检测器联用，但其灵敏度和选择性均低于质谱检测器12。试验用GB/T 223882008中第一法高效液相色谱法、第二法液相色谱-质谱/质谱法分别测定同一样品中的三聚氰胺含量13，同时测定样品加标回收率，找出2种方法的不足，并提出2种方法的优化措施。1材料与方法1.1仪器与设备DGU-20A高效液相色谱仪（岛津国际贸易有限公司）；ME104E电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DGU20A-API4500液质联用仪（美国AB SCIEX公司）；HT190R高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；JC-GX-24固相萃取仪（聚创华叶仪器实力有限公司）；KQ3200E超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；HSC-12A氮吹仪（北京佳航博创科技有限公司）。1.2材料与试剂三聚氰胺标准品（99.0%，Lot：G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺内标标准品（Melamine-13 C3，100 g/mL，CAS号1173022-88-2）；三聚氰胺质控样（3.820.70 mg/kg，TF01580051）；甲醇、乙腈、乙酸铵（均为色谱纯）；辛烷磺酸钠、乙酸铵、乙酸（均为优级纯）；氨水（25%28%）、三氯 143 研究探讨食品工业 2023 年第44卷第 4 期乙酸、柠檬酸，均为分析纯；乳粉（雀巢高钙营养奶粉）。1.3样品处理（高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法）样品处理见GB/T 223882008第一法高效液相色谱法、第二法液相色谱-质谱/质谱法。1.4液相色谱法的测定条件色谱柱CAPCELL PAK C18（4.6 mm250 mm，5 m）；流动相为离子对试剂缓冲液（柠檬酸、辛烷磺酸钠，pH 3）与乙腈（9010，V/V）；流速0.8 mL/min；柱温40；检测波长240 nm；进样体积10 L。1.5液相色谱-质谱/质谱法检测条件1.5.1液相条件色谱柱为强阳离子交换与C18混合填料，混合比例（14，150 mm2.0 mm，5 m）；流动相为乙酸铵溶液与乙腈（11，V/V），乙酸调至pH 3；进样体积10 L；柱温40；流速0.3 mL/min。1.5.2质谱条件扫描方式ESI+；离子喷雾电压4 500 V；雾化气为氮气，30 ps；干燥气为氮气，30 psi；离子化温度450。2结果与分析2.1标准曲线的绘制2.1.1高效液相色谱法准确称取10 mg三聚氰胺标准品于10 mL容量瓶中，用11的甲醇水（V/V）溶解并定容，配制成1 mg/mL的标准储备液，在4 下避光保存。用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释配制成系列浓度为0.4，0.8，1.0，5.0和10.0 g/mL的标准工作液，按1.4的条件进行检测，以峰面积为纵坐标，三聚氰胺浓度为横坐标，绘制标准曲线，见表1。2.1.2液相色谱-质谱/质谱外标法取空白样品按1.3的液相色谱-质谱/质谱法处理，所得溶液用作2.1.1中三聚氰胺标准储备液的稀释液，配制一系列浓度范围为60540 ng/mL标准工作液，按1.5的条件检测，以峰面积为纵坐标，三聚氰胺浓度为横坐标，绘制标准曲线，见表1。2.1.3液相色谱-质谱/质谱内标法分别取适量三聚氰胺中间液，加入适量三聚氰胺内标液，用11的甲醇水（V/V）溶液定容至10 mL，配制一系列浓度范围为60540 ng/mL标准工作液，内标浓度为20 ng/mL。以三聚氰胺与内标物峰面积比为纵坐标，三聚氰胺浓度为横坐标，绘制标准曲线，见表1。由表1可知：液相色谱法的三聚氰胺在0.410.0 g/mL浓度范围内的线性关系为y=69 824x+16 359，r=0.999 9；液相色谱-质谱/质谱法三聚氰胺在60540 ng/mL浓度范围内的线性关系为y=51.189x+562.61，r=0.997 3；内标法的三聚氰胺在60540 ng/mL浓度范围内的线性关系为y=0.049 5x+0.289 5，r=0.999 1。3种方法的线性关系较好，均可用于三聚氰胺的准确定量分析。表1不同定量方法的校准曲线标准曲线校准曲线r高效液相色谱法液质联用外标法液质联用内标法y=69 824x+16 359y=51.189x+562.61y=0.049 5x+0.289 50.999 70.997 30.999 22.2液相色谱法测定乳粉中三聚氰胺的含量现有已知三聚氰胺含量的乳粉质控样，三聚氰胺含量为3.820.7 mg/kg，采用GB/T 223882008第一法高效液相色谱法检测，计算回收率，所得结果见表2。由表2可知：液相色谱法测定乳粉质控样计算结果未在指定范围且回收率为81.4%；加标回收试验的回收率为83.1%，两者的回收率均在80%左右，说明完全按国标中液相色谱法检测三聚氰胺，无论质控样还是随行加标样均存在回收率较低的问题。可能的原因是在检测中存在提取不完全、先过滤后定容等不完善的步骤。表2液相色谱法测定三聚氰胺的结果编号指定值/(mgkg-1)测定值/(mgkg-1)回收率/%1(质控样)3.823.0781.42(加标样)4.123.3083.12.3液质联用法测定乳粉中三聚氰胺的含量为探究前处理、基质效应对测定结果的影响，对上述乳粉质控样及随行加标样均按照1.3中液质联用法的步骤进行前处理，所得溶液分别按1.5的条件测定，标准曲线定量计算，三聚氰胺的检测结果见表3。结果表明，液质联用法测定乳粉质控样及加标回收试验的回收率分别为82.7%和81.3%，回收率均在同一水平，说明按国标中液质联用法测定三聚氰胺，无论质控样还是加标样均存在回收率较低的问题。可能的原因是样品存在基质效应，虽然采取基质配标的方法消除，但只是降低基质效应的影响，未彻底消除。表3液质联用法测定三聚氰胺的结果编号指定值/(mgkg-1)测定值/(mgkg-1)回收率/%1(质控样)3.823.1682.72(加标样)4.123.3581.32.4液相色谱法的改进2.4.1液相色谱柱的选用GB/T 223882008高效液相色谱法中只规定液相色谱柱为C18色谱柱，但在试验中，三聚氰胺目标峰附近会出现三聚氰酸的杂质峰，尝试不同厂家生产的相同规格的液相色谱柱，仅资生堂和沃特世的液相色谱食品工业 2023 年第44卷第 4 期 144 研究探讨柱能完全分开三聚氰胺和三聚氰酸，建议使用这2个厂家的液相色谱柱。2.4.2超声时间和提取次数的优化GB/T 223882008高效液相色谱法中三聚氰胺的提取次数和超声次数均为1次，且超声时间仅为10 min。但在试验中，10 min的超声时间不足以完全将三聚氰胺提取出来。而且，提取次数1次势必残留部分三聚氰胺在残渣中，导致回收率偏低。方法优化为：准确称取2 g乳粉于离心管中，用12 mL三氯乙酸溶液（1%）和4 mL乙腈提取三聚氰胺，充分摇匀后超声提取30 min，取出振摇提取10 min，以10 000 r/min离心10 min；上清液转移至25 mL容量瓶中；残渣中加入6 mL三氯乙酸溶液（1%）和2 mL乙腈，按上述步骤提取1次，其余步骤同国标GB/T 223882008高效液相色谱法14-15。2.4.3过滤和定容的优化GB/T 223882008高效液相色谱法中，样品经15 mL三氯乙酸（1%）和5 mL乙腈提振荡、超声提取之后，经用三氯乙酸（1%）润湿的滤纸过滤，转移至25 mL容量瓶中定容。过滤过程中，三聚氰胺在滤纸上有残留，导致定容溶液中的三聚氰胺浓度偏低，从而使检测结果偏低。方法优化为将提取液转移至25 mL容量瓶中用三氯乙酸（1%）定容，弃去初滤液，从收集的滤液中移取5 mL用作待净化液。由表4可知，优化后的液相色谱法测定乳粉质控样及加标回收试验的回收率分别为99.0%和98.3%，回