端粒酶抑制因子X1过表达对...EC1细胞增殖及凋亡的影响_赵倩.pdf

28国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1 论著 端粒酶抑制因子 X1 过表达对人食管癌 EC1 细胞 增殖及凋亡的影响赵 倩 卢桂芳 刘亚萍 和水祥 任牡丹 李雅睿 杨振威【摘要】目的 探究端粒酶抑制因子 X1（PinX1）对人食管癌 EC1 细胞增殖及凋亡的影响。方法 体外培养人食管癌细胞系 EC1 细胞株，并将其分为空白对照（NG）组（空白对照细胞）、pcDNA 组（转染阴性对照质粒）、pcDNA-PinX1 组（转染 PinX1 过表达质粒）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）组（加入信号通路抑制剂）。采用实时荧光定量 PCR 法检测各组 PinX1 mRNA 的表达水平。分别采用 CCK-8 法和流式细胞术检测各组细胞的增殖、凋亡情况。采用荧光探针法检测各组活性氧簇（ROS）水平。采用蛋白质印迹法检测各组腺苷酸激活蛋白激酶/信号转导与转录激活因子 3（AMPK/STAT3）信号通路相关蛋白的表达水平。结果 经成功转染细胞后，与 NG 组、pcDNA 组比较，pcDNA-PinX1 组细胞的增殖抑制率、凋亡率、ROS 水平、p-AMPK/AMPK 均升高，而 p-STAT3/STAT3 均降低，差异均有统计学意义（P 均0.05）。与 pcDNA-PinX1 组比较，NAC 组细胞的增殖抑制率、凋亡率、ROS 水平、p-AMPK/AMPK 均降低，p-STAT3/STAT3 升高，差异均有统计学意义（P 均0.05）。结论 PinX1 过表达可抑制人食管癌 EC1 细胞增殖并诱导其凋亡，可能通过促进 ROS/AMPK/STAT3 信号通路活化来实现。【关键词】端粒酶抑制因子 X1；人食管癌 EC1 细胞；活性氧簇；增殖；凋亡DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2022.06.007Effect of overexpression of telomerase inhibitor X1 on proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma EC1 cells ZHAO Qian,LU Guifang,LIU Yaping,HE Shuixiang,REN Mudan,LI Yarui.Department of Gastroenterology,The First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University Medical College,Xian 710061,China;YANG Zhenwei.Department of Gastroenterology,Xian Central Hospital,Xian 710000,China【Abstarct】Objective This paper intends to investigate the effect of telomerase inhibitor X1(PinX1)on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma EC1 cells.Methods Human esophageal cancer cell line EC1 was cultured in vitro and assigned to the blank control(NG)group,the pcDNA group(transfected negative control plasmid),the pcDNA-Pinx1 group(transfected PinX1 overexpressed plasmid),and the N-acetyl-L-cysteine(NAC)group(added signaling pathway inhibitors).Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of PinX1 mRNA in each group.Cell proliferation and apoptosis were detected by using the CCK-8 method and flow cytometry,respectively.The reactive oxygen species(ROS)in each group were detected by fluorescence probe,and the expression of adenylate activated protein kinase/signal transduction and transcriptional activator 3(AMPK/STAT3)signaling pathways was detected by Western blotting.Results After successful transfection,compared with the NG group and the pcDNA group,the proliferation inhibition rate,the apoptosis rate,the ROS level,and the p-AMPK/AMPK in the pcDNA-Pinx1 group are increased,while p-STAT3/STAT3 are decreased,with 作者单位：710061 西安交通大学医学院第一附属医院消化内科（赵倩、卢桂芳、刘亚萍、和水祥、任牡丹、李雅睿）；710000 西安市中心医院消化内科（杨振威）通信作者：刘亚萍，Email:29国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1statistically significant differences(P0.05).Compared with the pcDNA-PinX1 group,the proliferation inhibition rate,the apoptosis rate,the ROS level,and p-AMPK/AMPK in the NAC group are decreased,while p-STAT3/STAT3 is increased,with statistically significant differences(P0.05).Conclusion The overexpression of PinX1 can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of human esophageal carcinoma EC1 cells,possibly by promoting the activation of ROS/AMPK/STAT3 signaling pathway.【Key words】Telomerase inhibitor X1;Human esophageal carcinoma EC1 cell;Reactive oxygen species;Proliferation;Apoptosis食管癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，具有恶性程度高、病死率高的特点，传统治疗方法如手术、放射治疗、化学治疗等的疗效并不理想，患者预后较差，给人们的生命健康带来严重威胁1。因此，寻找有效生物靶标靶向治疗食管癌以提高疗效是临床研究的热点。活性氧簇（ROS）是机体氧代谢过程的中间产物，高水平 ROS 可阻滞细胞周期，抑制细胞增生并诱导细胞氧化应激损伤、凋亡等2-3。端粒酶抑制因子 X1（PinX1）是一种新型肿瘤抑制因子4。刘杨等5的研究显示，PinX1过表达可显著增高食管癌细胞对放射治疗的敏感度，这可能与其促进细胞内 ROS 产生有关。信号转导与转录激活因子 3（STAT3）是一种 DNA 结合蛋白，在食管癌中异常高表达，有体外实验表明阻断其表达可抑制食管癌细胞的增殖和侵袭6。本研究通过探讨 PinX1 过表达对人食管癌 EC1 细胞增殖及凋亡的影响，并分析其与 ROS/腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）/STAT3 信号通路的关系，以期为临床寻找食管癌新的生物靶向治疗方法提供一定参考。1 材料与方法1.1 细胞培养人食管癌细胞系 EC1 细胞株购自北京北纳创联生物技术研究院。将 EC1 细胞解冻并复苏，置至含 10%灭活胎牛血清（FBS）的 RPMI-1640 培养液（购自上海经科化学科技有限公司），在 37、5%CO2的培养箱（购自北京泽平科技有限责任公司）中培养，每 23 日换液 1 次，传代培养。1.2 细胞分组及转染取 1.2 小节得到的对数生长期的 EC1 细胞接种至 24 孔板（密度为 2.5104个/孔），培养 24 h 后，待细胞融合至 70%80%时，更换为不含 FBS 的培养液。将细胞分为 4 组：（1）空白对照（NG）组，只含 EC1 细胞且未作其他处理；（2）pcDNA 组（阴性对照），使用转染试剂（LipofectamineTM 2000，购自上海抚生实业有限公司）将质粒 pcDNA（由上海延慕实业有限公司设计并合成）转染至EC1细胞；（3）pcDNA-PinX1 组（PinX1 过表达），使用转染试剂将质粒 pcDNA-PinX1（由上海延慕实业有限公司设计并合成）转染至 EC1 细胞；（4）N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）组（加入信号通路抑制剂），转染 pcDNA-PinX1 后，加入含抗氧化剂 NAC（摩尔浓度为 2.5 mmol/L，购自上海钰博生物科技有限公司）的培养液。各组细胞均使用不含 FBS 的培养液继续培养24 h。每组设置6个复孔，重复测量3次，使用倒置荧光显微镜观察各组荧光强度。1.3 PinX1 mRNA 表达水平检测采用实时荧光定量 PCR 法检测 PinX1 mRNA的表达水平。采用 TRIzol 法提取各组细胞中的总RNA，并测定其浓度和纯度。取 2 g RNA 进行反转录，所得 cDNA 进行 PCR 反应。配置 20 L 反应体系，包含 UltraSYBR Mixture 10 L、cDNA 模板 2.0 L、上下游引物各 2.0 L、去离子纯化水 4.0 L。反应条件：94 预变性 4 min；之后 95 变性 40 s，60 退火 30 s，72 延伸 2 min，进行 40 个循环。溶解度曲线：60 95，每 15 s 升温 0.3。以GAPDH 作为内参，采用 2Ct法计算 PinX1 mRNA的相对表达量。引物由上海杏园瑞民生物工程有限公司设计并合成，引物序列见表 1。表 1 引物序列引物名称序列PinX1正向：5-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3反向：5-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3GAPDH正向：5-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3反向：5-GGAACGCTTCACGAATTTG-31.4 细胞增殖情况检测采用 CCK-8 法检测各组细胞增殖情况。取 1.2小节中稳定转染的各组细胞，经胰酶消化，接种至 24 孔板（密度为 2.5104个/孔）。按照 CCK-8试剂盒（购自上海吉至生化科技有限公司）说明30国际消化病杂志 2023 年 2 月第 43 卷第 1 期 Int J Dig Dis，February 25，2023，Vol.43，No.1书操作，在细胞培养 24 h 后加入 10 L CKK-8 试剂，继续培养 2 h，之后检测 490 nm 处各孔细胞的光密度（OD）