超声辅助双水相提取南方红豆杉总黄酮的工艺研究_杨春燕.pdf

山东化工收稿日期:20220811基金项目:安徽高校自然科学研究项目(KJ2020A0791);安徽新华学院校级科研项目(2020zr004);国家级大学生创新创业训练计划项目(202112216069)作者简介:杨春燕，女，讲师，本科，主要从事药物分析研究。超声辅助双水相提取南方红豆杉总黄酮的工艺研究杨春燕1，卫强1，胡健力1，杨梦圆2(1安徽新华学院 药学院，安徽 合肥230088;2福元药业有限公司，安徽 宣城242000)摘要:目的:利用超声辅助双水相提取南方红豆杉中总黄酮的工艺研究。方法:以聚乙二醇(PEG)和碳酸钠等构成的双价水相晶体为测量介质，以芦丁为测量标准品，采取硝酸铝和亚硝酸钠比色法实验来计测总黄酮的含量。经过正交实验、单因素实验等来分析比较和综合考查超声时间、料液体积比、溶剂体积比和温度对黄酮含量的影响。结果:红豆杉枝叶中总黄酮的最佳提取工艺条件为料液比为1 50(g mL)，超声溶解时间为 20 min，溶剂体积浓度比等于 6 4，提取温度 30，提取循环 3 次时，总黄酮产率最高。结论:结果重现性比较好，则认为该方法工艺相对稳定和可行。关键词:超声辅助双水相;红豆杉;总黄酮;工艺研究中图分类号:TQ461文献标识码:A文章编号:1008021X(2023)03003403Study on Ultrasoundassisted Extraction of Total Flavonoids fromTaxus Chinensis Leaves and BranchesYang Chunyan1，Wei Qiang1，Hu Jianli1，Yang Mengyuan2(1School of Pharmacy，Anhui Xinhua University，Hefei230088，China;2Fuyuan Pharmaceutical Plc，Xuancheng242000，China)Abstract:Objective:To study the process of extracting total flavonoids from southern yew by ultrasoundassisted bihydrate phaseMethods:The total flavonoids were measured by the bivalent aqueous crystal composed of polyethylene glycol(PEG)and sodiumcarbonate as the measuring medium，and rutin as the measurement standard，and the colorimetric experiment of aluminum nitrateand sodium polynitrite was used to measure the total flavonoidsThrough orthogonal experiments and univariate experiments，theeffects of ultrasound time，materialliquid volume ratio，solvent volume ratio and temperature on flavonoid content were analyzedand comprehensively examinedesults:The optimal extraction process conditions for total flavonoids in yew branches and leaveswere 1 50，ultrasonic dissolution time was 20 min，solvent volume concentration ratio was equal to 6 4，extraction temperaturewas 30，and the total flavonoid yield was the highest when the extraction cycle was carried out three timesConclusion:Thereproducibility of the results is relatively good，and the process is considered to be relatively stable and feasibleKey words:ultrasonic assisted aqueous twophase;chinese yew;total flavonoids;process research南方红豆杉1(Taxus wallichiana varMairei L)为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物。红豆杉也是远古第四冰川纪留下来的 50 多个罕见物种中珍贵的物种之一，迄今已经有250 多万年的历史，是自然的“活化石”2。红豆杉属在中国的云南、西藏、安徽等地都有分布，其中的变种南方红豆杉就在安徽地区有分布。南方红豆杉大多生得高大挺拔粗壮，有的甚至可以长到 30 m，主干直径可达 1 m，叶片常年都是绿色，在每年的五六月份开花，大约在同年的九十月份结果。红豆杉的根、皮、枝、叶等部位中含有紫杉醇、紫杉烷类等化合物，具有良好的抗癌效果，亦含有二萜类、黄酮类、挥发油等其他组分3。红豆杉为我国一级保护植物，并在中国古代就被发现可以入药，有多种药用价值。据记载，唐代的孙思邈在采药过程中发现红豆杉，由于红豆杉表皮呈现红褐色，故称其紫杉，因为红豆杉散发香气，尝试将其制药使用，发现红豆杉有通经、利尿、消水肿等作用。后来的科学研究中也发现，它的种子含油量很高，树皮还含有单宁、紫杉醇等成分，单宁作为鞣酸具有将蛋白质凝固的效果，而紫杉醇则被发现是一种天然的珍稀的抗癌物质。总黄酮是一类天然产物，是一种对 2苯基色原酮的骨架衍生物的统称，根据其化学结构的特点可以分为不同的类型4。黄酮类化合物广泛存在于自然界植物里的各种天然有机植物种子细胞中，属于任何一种天然植物色素及其次生代谢系统中重要的次级合成产物。但是，也有很少部分特殊的生物种类则是完全地以一种游离苷基的形式单独存在。研究发现，黄酮类化合物具有抗衰老、抗细胞缺氧、抗疲劳、增强人类身体免疫力、延年益寿、抗癌等生理活性。近年来，由于总黄酮类在清除自由基这一方面表现出的作用而得到重视。经过多重研究更是可以发现，不同的黄酮类化合物对一些常见癌症均有不同程度的抑制功效。总黄酮这类化合物不止能有效减缓癌细胞的生长速度，而且它也能对癌细胞的死亡产生效果，有效延长抗肿瘤药物在体内发挥作用的时间，使其成功达到抗肿瘤的功效。另外，总黄酮类化合物还能够透过调控炎症细胞因子和炎症细菌的方式，对人体心血管网络系统起到保护作用。除此以外，总黄酮类化合物还具备抗肝肾中毒、抗菌、抗病毒、抗自由基、抗氧化物及增强免疫力功能等多项药物功效。到目前为止，总黄酮类物质的这些生理活性与功能均在研究和临床药物的使用上得到一定程度的验证与利用。黄酮类化合物常用的提取方法有碱提取酸沉淀法、微波辅助提取法、酶辅助提取法等等。其中，黄酮类化合物较为常见的提取方法是有机溶剂提取法5。超声波提取法是一种较为新颖的方法，与其他提取方法等方法相比，它所提取的总黄酮的纯度较高、提取效率较好，而且实验操作简便、实验条件更易实现。超声波提取工艺更充分地提取各种有用成分。因其操作易行，在一定程度上能缩短提取时间，若与其他提取方法共同应用能显著增加提取效率，更充分地提取各种有用成分。超43SHANDONG CHEMICAL INDUSTY2023 年第 52 卷DOI:10.19319/ki.issn.1008-021x.2023.03.009第 3 期声波提取总黄酮的工艺优化与样品的种类、样品所含的化学成分及本身的黄酮含量等关系密切，因此应考虑使用与之相匹配的工艺路线，从影响提取率的提取溶剂浓度、提取时间、料液比等因素考虑优化出最合理的参数路线6。超声辅助提取法较其他总黄酮提取法具有更多的优势，已逐渐被应用到总黄酮的提取中。田晓晶等7 通过实验得知，超声辅助提取能有效提升总黄酮的产率。Peng 等人8 还采用了超声波辅助法成功从苦荞肉中分别提取和纯化了芦丁甙、槲皮素和山奈酚苷等 3 大种天然黄酮类物质，并为此对其提取分离工艺设计进行了系统优化，提取率达到了 394%。总黄酮含量测定常用的方法包括紫外分光光度法、液相色谱法及毛细管电泳法等。紫外分光光度法利用不同物质对不同波长的光的吸收程度不同这一性质，通过测定并绘制被测物吸收波长在 190800 nm 范围内的物质吸光度的吸收图谱，再通过与对照品在同一波长范围内所得到的吸收图谱相比较、分析和计算，从而可用于含量测定。因紫外分光光度法相较于其他方法操作较为简单且结果可靠，被广泛应用于总黄酮类物质的各项检测实验中。综上所述，本实验采用紫外分光光度法进行总黄酮吸光度的测定，并进行相应的产率计算。本实验采取超声波辅助双水相提取法对南方红豆杉进行总黄酮的提取，主要是以由聚乙二醇钠(PEG)与碳酸钠混合形成的双水相体系溶液为研究介质9，超声技术辅助提取南方红豆杉块茎中含的红豆杉总烯黄酮，提高萃取效率，成本极其低廉，操作相对简单，探究最佳的提取工艺10。1材料与仪器11药材新鲜红豆杉枝叶，摘自安徽省黄山市，由安徽新华学院药学院卫强老师鉴定为南方红豆杉。12主要试剂芦丁对照品(批号:100080201811，纯度要求大于 98%);聚乙二醇(PEG)，乙醇，无水碳酸钠，亚硝酸钠，硝酸铝(均为分析纯试剂，由安徽新华学院药学院实验室提供)。13主要仪器UV1000 紫外可见分光光度计，FA2004 型电子天平，KQ300DB 型超声波清洗器，FW135 型中药粉碎机，DZF6090 型真空干燥箱。2方法21双水相体系的选择分别配制质量分数为不同梯度的聚乙二醇溶液(20%，25%，30%，35%，40%)和不同梯度的碳酸钠溶液(10%，12%，14%，16%，18%，20%)。在总体积一样的情况下，分别按体积比(9 1，8 2，7 3，6 4，5 5，4 6，3 7，2 8，1 9)取聚乙二醇溶液和碳酸钠溶液，并充分混合后，静止数分钟后，仔细观察溶液的分层情况。22黄酮标准曲线的绘制选择以芦丁为对照品，采用亚硝酸钠硝酸铝比色法对红豆杉中总黄酮进行含量测定。精密等量地称取芦丁对照品，并将对照品按照 10 mg/组分别置于总容积 10 mL 的玻璃容量瓶中密封。精密进行相对定容，用双水相法对上相进行定容后，密封超声提取 30 min，分别精确量取 0，04，08，12，16，20 mL 加入 10 mL 的容量瓶中，再分别量取 03 mL 5%亚硝酸钠溶液加入。摇匀充分，并置于避光处 10 min。接着，再加入 03 mL 10%浓硝酸铝溶液，充分摇匀使其混合均匀后，再于避光处放置 5 min。最后，再加入 2 mL4%氢氧化钠溶液，定容，再经过充分摇匀后，于避光处放置10 min后取出待用。于波长 510 nm 处，采用分光光度法测量其吸光度，并绘制吸光度浓度标准曲线。23红豆杉中总黄酮的分离提取称取 5 g 红豆杉枝叶粉末，按“原料/溶液”质量比 1 30 加至溶液 150 mL 后，置于双水相体系瓶中。双水相用 20%聚乙二醇溶液和 4%碳酸钠溶液适量按体积比 5 5 进行配制，在恒温 30 的干燥条件下用超声泵提取药材60 min，过滤混匀后进行分液，分别提取药材上下两相。24单因素实验设计红豆杉总黄酮采用超声辅助双水相法进行提取，有多种因素如液料比、乙醇浓度、提取温度、超声提取时间、超声波功率、乙醇浸泡时间、样品新鲜程度等多种因素都会对总黄酮提取率造成影响。本实验选择温度、提取时间、料液比及 20%PEG 溶液和 4%碳酸钠溶液体积比