不同叶龄红小豆叶片的转录组分析_董伟欣.pdf

收稿日期:20220507修回日期:20220709基金项目:河北省自然科学基金项目(C2021204045);国家现代农业产业技术体系项目(CAS-08-G-22)作者简介:董伟欣(1983)，女，副教授研究方向:作物栽培Email:415142252 qqcom通信作者张月辰(1964)，男，教授，博士研究方向:作物栽培Email:zhangyc1964 126com不同叶龄红小豆叶片的转录组分析董伟欣1，2，张磊1，李东晓1，张月辰1(1河北农业大学农学院/华北作物改良与调控国家重点实验室，河北 保定 071000;2河北开放大学，河北 石家庄 050080)摘要:为揭示红小豆苗期不同叶龄基因表达量的变化，以晚熟品种 唐山红小豆 为材料，通过 NA-Seq 技术对 3 叶龄和 6叶龄红小豆叶片进行转录组比较分析结果表明:两个样本的转录组测序共得到 941106个原始 reads，过滤后得到 9231106个 clean reads，Q30 比例为 9417%，GC 含量为 4368%，能定位到基因组序列上的碱基数占 9777%，在参考序列上有唯一比对序列数占 9307%;两个样本共获得 6 314 个差异表达基因，其中，3 059 个基因上调表达，355 个基因下调表达，对差异基因进行 GO 和 KEGG 分析，发现差异表达基因主要富集在光信号接收、昼夜节律、光合作用天线蛋白、淀粉蔗糖和植物激素信号转导等代谢途径上，其中植物激素信号转导代谢途径中的差异表达基因数目最多，达 108 个;从昼夜节律、天线蛋白和植物激素信号转导代谢途径中各选取 2 个差异显著的基因进行验证，结果与 FPKM 值趋势一致红小豆转录组测序数据准确可靠，苗期生长发育受到光合作用、淀粉和蔗糖、昼夜节律和植物激素等代谢途径的调控，为红小豆的开花结荚提开放科学(资源服务)标识码(OSID)供保障该结果为进一步研究红小豆苗期生长过程中相关基因的动态变化提供依据关键词:红小豆;3 叶龄和 6 叶龄叶片;转录组;实时荧光定量 PC中图分类号:S52101文献标识码:A文章编号:1671-5470(2023)03-0285-09DOI:1013323/jcnkijfafu(natsci)202303001Transcriptome analysis of adzuki bean leaves at different agesDONG Weixin1，2，ZHANG Lei1，LI Dongxiao1，ZHANG Yuechen1(1College of Agronomy/State Key Laboratory of Crop Improvement and egulation in North China，Hebei AgriculturalUniversity，Baoding，Hebei 071000，China;2Hebei Open University，Shijiazhuang，Hebei 050080，China)Abstract:To reveal the changes in gene expressions of Vigna angularis(adzuki bean)during seedling stage，comparative transcrip-tomic analysis of leaves from late maturing variety ofTangshan adzuki beangrown at 3-and 6-leaf stages was performed by NA-Seq A total of 9231106clean reads were filtered from 941106raw reads with a Q30 value of 9417%and GC content of 4368%The results covered 9777%genomic sequences and 9307%sequences were uniquely aligned to the reference genome A total of6 314 differentially expressed genes(DEGs)were obtained，among which 3 059 were up-regulated and 3 255 were down-regulatedGene Ontology(GO)analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)analysis revealed that these DEGs mainlyparticipated in the metabolic pathways concerning light signal reception，circadian rhythm，photosynthesis-antenna protein，metabo-lisms of starch and sucrose and plant hormone signaling，and the most number of DEGs(108)were detected from the pathways reg-ulating plant hormone signaling Two significant DEGs，selected from pathways related to circadian rhythm，antenna protein andphytohormone signaling were further validated by qT-PC，and the results were consistent with the trend of FPKM values To sum-marize，the growth of adzuki bean seedling was regulated by metabolic pathways involving photosynthesis，starch and sucrose synthe-sis，circadian rhythm and phytohormones，which provide material bases for the flowering and pod development of adzuki beanKey words:adzuki bean;leaves at 3-and 6-leaf stage;transcriptome;real-time fluorescent quantitative PC红小豆(Vigna angularis)起源于中国1，是重要的杂粮作物之一，红小豆不仅具有丰富的营养物质，还具有较高的药用和保健价值2，因此在人类食谱中占有重要地位然而，红小豆作为一种小杂粮作物，被重视程度不够，品种混杂退化，加之小豆花荚脱落严重，产量低且不稳定成为生产中的难题3 利用红小豆苗期日照时间调控开花时间对于后期产量和品质的提升具有显著影响，因此，通过转录组学对不同叶龄红小福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷 第 3 期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition)2023 年 5 月豆叶片进行研究，这对于深入了解红小豆生长发育的代谢过程具有重要意义随着测序技术不断发展和成本逐渐降低，转录组学已经广泛应用到不同物种大豆转录组测序分析表明，lncNA77580 是响应逆境和生长发育过程中有重要功能的长链非编码 NA，另外，通过转录组测序技术挖掘控制大豆百粒重的基因以及糖代谢过程中抗旱基因的表达情况，为大豆抗逆基因的深入研究以及产量提升奠定了基础46 在其他作物上，对野生型粳稻品种中花 11 进行转录组学研究，鉴定出响应低温胁迫基因 31 个，其中 25 个基因上调表达，6 个基因下调表达，这为揭示水稻响应低温的分子机制提供了依据7 玉米转录组测序分析表明，在低磷胁迫下玉米叶片的表型变化与相关基因存在调控规律8 转录组测序技术已经被应用到植物育种、逆境胁迫、遗传多样性分析、种质资源挖掘等方面关于红小豆转录组方面的研究，仅在锈菌侵染9 和矮秆窄叶10 等方面有报道，在其生长发育过程中相关基因表达却未见报道基于此，本试验选择晚熟品种 唐山红小豆3 叶龄和 6 叶龄叶片作为试验材料，对其进行转录组测序分析，探究红小豆不同叶龄时期生长发育过程中的差异基因数目及表达情况，为深入挖掘红小豆苗期生长过程中显著差异基因的动态变化提供依据1材料与方法11试验设计试验于 2021 年 7 月在河北农业大学教学实验基地(东经:11547，北纬:3887)进行，小区长 5 m，宽1 m，种植 2 行，株行距为 15 cm40 cm，随机区组排列，共 10 个小区，选取 3 叶龄(真叶展平后 5 d，简称:5d)和 6 叶龄(真叶展平后 15 d，简称:15 d)无病害、长势良好的唐山红小豆(种子由河北省农林科学院粮油作物研究所提供)三出复叶的中间叶片，810 株混合在一起，每个样品 3 次重复，共 6 个样品以自然光照时间(natural photoperiod，NPD)作为标记，分别为 NPD-5 d-1、NPD-5 d-2、NPD-5 d-3、NPD-15 d-1、NPD-15 d-2、NPD-15 d-3，采样后立刻放入液氮带回实验室，于80 冰箱中保存12NA 的提取与检测以红小豆三出复叶的中间叶片为材料提取 NA，NA 采用试剂盒(mirVanaTMmiNA ISOlation Kit，Ambion-1561)提取，参照说明书步骤进行测定，用 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测 NA 样品的纯度、浓度和完整性13测序与分析试验采用双端测序，以红小豆(网址:https:/ftpncbinlmnihgov/genomes/all/GCF/001/190/045/)的基因组作为参考基因组11 用带有 Oligo(dT)的磁珠富集 mNA，加入打断试剂将 mNA 打断成短片段，以打断后的 mNA 为模板，用 6 碱基随机引物合成一链 cDNA，配制二链合成反应体系合成二链 cDNA，并使用试剂盒纯化双链 cDNA，纯化的双链 cDNA 再进行末端修复，加 A 尾并连接测序接头，然后进行片段选择，最后进行 PC 扩增，构建的文库利用 Illumina HiSeqTM 2500 测序仪进行测序14差异基因筛选FPKM12 和 count 使用 bowtie213 和 eXpress14 软件分析得到通过 eXpress 软件获取各个样本中转录本(protein coding)的 reads 数目，使用 DESeq package 的 estimateSizeFactors 函数对数据进行标准化，并使用 nbinomTest 函数计算差异比较的 P-value 和 fold change15 15差异基因富集分析挑选出 P005、差异倍数2 的差异转录本，使用 Blast2 GO 软件对得到的所有差异基因进行 GO 注释，用 WEGO 软件对所有的差异基因进行 GO 功能分类统计GO 注释包括 3 个主要功能组别，即:生物学过程(biological process)、分子功能(molecular function)和细胞组分(cellular component)通过 BLAST 软件将基因序列比对到京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库，进行基因生化途径注释，对差异基因调控的生物体代谢网络进行鉴定16 16实时荧光定量 PC(qT-PC)采用