串联质谱与高通量测序技术联...新生儿疾病筛查中的应用价值_皮双双.pdf

DOI1019793/jcnki1006-6411202309043工作单位湖南省儿童医院新生儿一科长沙41000作者简介皮双双，女，本科，护师收稿日期2021-10-11 经验与创新串联质谱与高通量测序技术联合检测在新生儿疾病筛查中的应用价值皮双双熊月娥王力周钝敏摘要目的探索串联质谱(tandem mass spectrometry，TMS)联合高通量测序技术(next generation sequencing，NGS)应用于新生儿疾病筛查中的价值。方法以长沙市 2016 年 6 月2019 年 6 月期间所筛查的 62 548 例新生儿为研究对象，以 TMS 对其进行初筛，以 NGS 对初筛阳性病例进行鉴别诊断和基因诊断。结果62 548 例新生儿中初筛共存在 794 例阳性，经召回 TMS 检测后，共68 例新生儿表现为阳性，对 68 例新生儿进行 NGS 技术检测后，仅 24 例新生儿确诊为阳性，总体发病率为 1/2 606。结论针对新生儿疾病的筛查，采用 TMS 联合 NGS，能够尽早并有效地发现新生儿存在的遗传疾病，由此给予相应的干预治疗，从而提升新生儿质量。关键词串联质谱;高通量测序技术;新生儿疾病筛查我国作为人口居世界前列的国家，新生儿出生缺陷率同样位居世界高水平，相关统计数据显示，我国出生缺陷率约为 56%，且每年约新增 90 万例的缺陷新生儿。遗传代谢类疾病是因基因突变致使新生儿体内蛋白质分子结构及功能出现改变，进而使其酶受体及载体出现相应的缺陷，由此引发机体的生化反应及代谢功能异常1。新生儿遗传代谢类疾病往往可通过其临床表现或血液检测进行诊断，在上世纪末期，TMS 技术成功转化应用于新生儿疾病筛查中，并获得了较为良好的表现;但结合部分遗传代谢类疾病所具有的表现复杂、涉及指标广泛等因素，故针对疑似阳性的新生儿诊断则具有一定难度2-4。为预防新生儿出现出生缺陷，对其进行产前筛查则显得尤为必要，传统的产前筛查多采用侵入性诊断的方式进行，即获取胎儿的细胞进行培养，后进行核型检测，该技术存在相应的难度，并存在流产风险及并发症风险。故在针对新生儿进行筛查时，其方向逐渐向无创筛查进行。NGS 技术是近年来医学检验领域的一大热门，又被称为新一代测序技术，其检测较 TMS 更为方便快捷，能够同时对数以万计的基因分子进行测序，是当下筛查新生儿遗传疾病的中坚力量5-6。本文旨在研究以 TMS 联合 NGS对新生儿疾病进行筛查，现报道如下。1材料与方法11试验对象以长沙市 2016 年 6 月2019 年 6月期间所筛查的 62 548 例新生儿为研究对象，其中男 32 525 例，女 30 023 例;单胎共 62 046 例，占比为9920%;城区共 55 117 例，占比为 8812%，乡镇共7 431 例，占比为 1188%;正常体重新生儿共 58 532例，占比为 9358%，低体重新生儿共 4 016 例，占比为 642%。新生儿样本纳入研究时，其年龄均在 35 d 之间，平均日龄为(403021)d，平均体重为(253030)kg3，平均身长为(5210702)cm，平均头围为(2125210)cm。筛查人员为湖南省某医院新生儿一科护士。本次研究经医院伦理委员会批准，纳入对象的监护人均签署知情同意书。12样本采集取新生儿足跟处血液，以专用滤纸(芬兰 Wallac Oy Turku 提供)制作干血滴滤纸标本，标本干燥后将其密封，置于 4 环境下保存，于 7 d内完成 TMS 检测。对疑似阳性的新生儿及其父母，均取静脉血 5 mL，采用 EDTA 抗凝法保存血液，以备 NGS 技术检测基因。样本采集过程严格参照实验室新生儿疾病筛查技术规范进行，并由专业的检验人员对血液样本进行采集。13试验方法筛查流程为 TMS 初筛、原血片复查及召回复查;诊断流程为鉴别诊断、基因诊断及随访诊疗。131筛查与诊断TMS 初筛采用 AcquityTM TOD串联质谱平台(美国 Waters 提供)，以非衍生化法对新生儿血液制片进行 TMS 筛查，严格按试剂盒(美国 PerkinElmer 提供)说明书进行操作。由儿科的临床医师结合特异性指标的异常变化及临床特点，对疑似阳性的新生儿结果进行判断。若出现截断值显著高于正常水平的疑似阳性，则即刻进行复查，而后对其他原血片进行复查，结合两次结果，对其进行召回复查。筛查后出现的阳性样本，应结合疑似疾病的特点，对其进行相应的血气、血氨、血糖、乳酸等生化检测，若存在有机酸代谢疾病，则应进行尿气相色谱检测;疑似程度高的新生儿病例，则进行基因751当代护士 2023 年 3 月第 30 卷第 9 期(下旬刊)诊断7。132基因检测采用遗传代谢病基因检测拓展版捕获 Panel(杭州甄元健康提供)，以多重探针杂交法靶向 306 个基因的目标区域序列，基因包含286 种疾病及其亚型。对疑似阳性的新生儿致病基因则以 NGS 进行检测，NGS 检测采用高通量测序仪(美国 illumina 提供，型号 HiSeq 2500)。对于新生儿致病位点验证，则采用 Sanger 测序进行检测，San-ger 测序采用一代测序仪平台(美国 Applied Biosys-tems 提供，型号 ABI 3500XL)。133随访治疗参照遗传代谢性疾病的临床诊治进展8 的相关标准，为确诊阳性的新生儿建立相应的遗传代谢病档案，并给予新生儿对症治疗及长期关注随访。2结果21筛查基本状况本次研究共纳入 62 548 例新生儿，其中经 TMS 初筛后，共 794 例新生儿被判断为初筛阳性，初筛阳性率为 127%;初筛阳性新生儿中，成功召回 723 例，召回率为 9106%;剩余 71 例经 TMS 再次检测，其中 68 例仍呈阳性，复查阳性率为 9577%。结合疑似阳性疾病种类的不同，对 68 例新生儿进行鉴别诊断及基因诊断，最终共有 24 例新生儿确诊存在遗传代谢病，其总体发病率为 1/2 606;其中氨基酸类疾病 9 例，有机酸类疾病 9 例，脂肪酸类疾病 6 例。共含 11 种疾病，单病种发病率在1/62 5485/62 548 之间，其中发病率最高的为苯丙酮尿症，见表 1。表 1确诊阳性新生儿筛查基本状况疾病类型例数编号TMS 初筛值随访复查值氨基酸类疾病9苯丙酮尿症51Phe:37705 phr/tyr=524Phe:45935 phr/tyr=7532Phe:84316 phr/tyr=2480Phe:92315 phr/tyr=25143Phe:157312 phr/tyr=3328Phe:175472 phr/tyr=32524Phe:18514 phr/tyr=284Phe:13827 phr/tyr=3155Phe:44815 phr/tyr=642Phe:65421 phr/tyr=823瓜氨酸血症型26cit=31524Cit=428147cit=33484Cit=53911高甲硫氨酸血症18met=13523Met=16482希特林蛋白缺乏症19cit=22513Cit=37242有机酸类疾病9戊二酸血症型410C5DC+C6OH=381C5DC+C6OH=32511C5DC+C6OH=352C5DC+C6OH=39812C5DC+C6OH=329C5DC+C6OH=32313C5DC+C6OH=334C5DC+C6OH=3423-甲基巴豆酰辅酶 A 羧化酶缺乏症314C5DC+C6OH=192C5DC+C6OH=18615C5DC+C6OH=859C5DC+C6OH=86116C5DC+C6OH=512C5DC+C6OH=620甲基丙二酸血症217C3=1012 C3/C2=098C3=534 C3/C2=35118C3=678 C3/C2=062C3=684 C3/C2=092脂肪酸类疾病6原发性肉碱缺乏症219C0=648C0=45220C0=612C0=437短链酰基辅酶 A 脱氢酶缺乏症221C4=123C4=13122C4=119C4=111中链酰基辅酶 A 脱氢酶缺乏症123C6=078 C6DC=034 C8=052C6=035 C6DC=023 C8=128-酮硫解酶缺乏症124C3DC+C4OH=363C4DC+C5OH=126C3DC+C4OH=113C4DC+C5OH=10322基因检测基本状况24 例新生儿中共 19 例自愿接受了 NGS 基因检测，均表现为致病基因携带两个位点突变，即为杂合突变;结合数据库查询结果可知，29/30 位点具有显著的致病性。19 例新生儿中，共 17 例进行了父母样本采集，结合家系突变验证可知，其突变分别源于父母双方，突变同样符合基因型851Modern Nurse，March，2023，Vol30，No9表型共分离原则。其余 2 例未采集父母样本的新生儿，对其进行随访调查得知，其父母均为非近亲结合。阳性新生儿基因检测结果见表 2。表 2确诊阳性新生儿基因检测基本状况疾病类型例数编号致病基因核苷酸改变氨基酸改变变异类型致病性突变来源氨基酸类疾病6苯丙酮尿症31PAHc722CTp251C杂合致病突变父亲C1065CApY358X杂合致病突变母亲3PAHc723CTp267C杂合致病突变父亲C1069CApY362X杂合致病突变母亲5PAHc721CTp252C杂合致病突变父亲C1064CApY381X杂合临床意义未明母亲瓜氨酸血症型26ASS1C1163GApG391杂合致病突变父亲C1126_1136delinsGpSMN378S杂合致病突变母亲7ASS1C1158GApG383杂合致病突变父亲C1121_1132delinsGpSMN352S杂合致病突变母亲希特林蛋白缺乏症19SLC25A13C853_856delTAATGpM279Pfs*2杂合致病突变父亲IVS15ins4kbpA573Vfs*2杂合致病突变母亲有机酸类疾病7戊二酸血症型311GCDHc1234CApT419N杂合致病突变父亲c12432ACSplicingError杂合致病突变母亲12GCDHc895GApA296T杂合致病突变父亲c253_513423delinsATA杂合致病突变母亲13GCDHc107_111delCApQ36Efs*5杂合致病突变父亲c418CGpS138W杂合致病突变母亲3甲基巴豆酰辅酶 A 羧化酶缺乏症214MCCC1c293GApG96S杂合致病突变未验证c638+3TASplicingError杂合致病突变未验证16MCCC1c675CTpQ228X杂合致病突变父亲c162TCpI57T杂合致病突变母亲甲基丙二酸血症217MMACHCc13351GApL448V杂合致病突变未验证c727_731insTTpD243Lfs*39杂合致病突变未验证18MUTc2AGpM3V杂合致病突变父亲c428+1GTSplicingError杂合致病突变母亲脂肪酸类疾病6原发性肉碱缺乏症219SLC22A5c854CTp281X杂合致病突变父亲c1405CGpS463C杂合致病突变母亲20SLC22A5c924CTp293X杂合致病突变父亲c1463CGpS458C杂合致病突变母亲短链酰基辅酶 A 脱氢酶缺乏症221ACADSc168CTpE348G杂合致病突变父亲c1034AGpP372L杂合致病突变母亲22ACADSc793GAp53L杂合致病突变父亲c1068GApE328G杂合致病突变母亲中链酰基辅酶 A 脱氢酶缺乏症123ACADMc1033AGpG265杂合致病突变父亲c1128CTpG369E杂合致病突变母亲酮硫解酶缺乏症124ACAT1c726dupApT243Nfs*15杂合致病突变父亲c934GCpA314P杂合致病突变母亲23治疗随访情况本次研究所确诊的 24 例阳性新生儿，结合其疾病类型及发展程度，给予其相应的治疗手段，其中 1 例新生儿因先天性心脏病入院治疗出现危重病情，新生儿死亡，其余 23 例患儿因及时接受干预，即建立随