超高效液相色谱-串联质谱法...苷酸及其4种前体化合物含量_邱世婷.pdf

茶叶科学 2023，43（2）：216226 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期：2023-01-04 修订日期：2023-03-03 基金项目：国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP20220207）作者简介：邱世婷，女，硕士研究生，研究方向为农产品质量安全与营养。*通信作者： 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸及其 4 种前体化合物含量 邱世婷1,2，侯雪1,2*，雷绍荣1,2，韩梅1,2，贺光云1,2，李莹1,2，覃蜀迪1,2 1.四川省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，四川 成都 610066；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（成都），四川 成都 610066 摘要：烟酰胺核糖体（NR）、烟酰胺单核苷酸（NMN）、烟酸（NA）和烟酰胺（NAM）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的 4 个前体化合物，口服后可在体内转化为 NAD+发挥抗衰老等功效。建立了采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定茶叶中 NAD+及其 4 种前体化合物含量的方法，茶叶经水提取，稀释后直接进行 UPLC-MS/MS 分析。经方法学验证，5 种目标化合物在各自范围内线性关系良好（R20.99），回收率为 70.00%120.00%，相对标准偏差为 2.09%14.50%，方法的定量限为 0.100.50 gL-1。绿茶、红茶和黑茶中 5 种目标化合物的含量测定结果显示，绿茶和红茶是 NR、NMN、NAD+的良好天然食物来源；主成分分析结果显示，根据 5 种化合物含量能对红茶、绿茶、黑茶进行良好的类群区分；聚类分析结果显示，同一产地同一类型茶叶中 5 种化合物质量分布不均，离散度较高，无法进行区分。关键词：茶叶；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；烟酰胺单核苷酸；烟酰胺核糖体；超高效液相色谱-串联质谱 中图分类号：S571.1；O657 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2023)02-216-11 Simultaneous Determination of Nicotinamide Adenine Dinucleotide and Its Four Precursors in Tea by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry QIU Shiting1,2,HOU Xue1,2*,LEI Shaorong1,2,HAN Mei1,2,HE Guangyun1,2,LI Ying1,2,QIN Shudi1,2 1.Institute of Quality Standard and Testing Technology Research,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;2.Laboratory of Risk Assessment for Agricultural Product(Chengdu),Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Chengdu 610066,China Abstract:Nicotinamide ribosome(NR),nicotinamide mononucleotide(NMN),nicotinic acid(NA)and nicotinamide(NAM)are 4 precursor compounds of NAD+,which can be converted to NAD+in vivo to work after oral administration.This study established a method for simultaneous determination of NAD+and its four precursors in tea by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The tea samples were extracted by water,then diluted and directly analyzed by UPLC-MS/MS.Method validation shows this method has good linearity in their respective range with correlation coefficients(R2)higher than 0.99.The average recoveries ranged from DOI:10.13305/ki.jts.2023.02.0122 期 邱世婷，等：超高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶叶中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其 217 70.00%to 120.00%with relative standard deviations(RSDs)of 2.09%-14.50%.The limits of quantitation(LOQs)were 0.10-0.50 gL-1.The determination results of five target compounds in green tea,black tea and dark tea show that green tea and black tea were the good natural food sources of NR,NMN,NAD+.The results of principal component analysis show that the contents of five compounds could well distinguish black tea,green tea and dark tea.The cluster analysis shows the same type of tea from the same origin was of uneven quality,with high dispersion in samples,and it was difficult to identify each other.Keywords:tea,nicotinamideadenine dinucleotide(NAD+),nicotinamide nononucleotide(NMN),nicotinamide riboside(NR),UPLC-MS/MS 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+，辅酶）是一种参与人体各种生理过程的辅酶，在维持细胞生长、分化和能量代谢及细胞保护方面起着重要作用1-2。人体中 NAD+水平会随着年龄增加而不断下降3-4，从而引起机体一系列生理机能衰退和退行性病变5-6，如何恢复衰老机体内正常 NAD+水平，已成为目前研究的热点。由于 NAD+分子过大，直接口服很难穿过细胞膜进入体内7，口服其前体化合物是提升体内NAD+水平的手段之一。烟酰胺（Nicotinamide，NAM）和烟酸（Nicotinic acid，NA）两种化合物被认为是合成 NAD+的两个膳食前体8，但两者大剂量使用对人体均存在副作用，如烟酸易引起人体面部潮红，烟酰胺会引起肝脏毒性等9-10。后续研究发现，烟酰胺的核糖化形式烟酰胺核糖体（Nicotinamide riboside，NR）及NR的 磷 酸 化 形 式 烟 酰 胺 单 核 苷 酸（Nicotinamide mononucleotide，NMN）也是NAD+合成的重要细胞外前体化合物11-12。NMN 是 NAD+最直接高效的前体物质，NR 功效虽仅有 NMN 的 1/1507，但已有多项研究证明体外补充 NMN 或 NR 可显著增加动物体细胞内 NAD+含量13，发挥抗衰老、增强细胞活力、减弱认知退化等作用14-17，同时对人体无毒副作用18。Mills 等14研究发现，当 NMN给药含量为 100 mgkg-1d-1时，能够减轻小鼠大多数与年龄相关的生理衰退疾病，而人类的等效表面积剂量为 8 mgkg-1d-1。Yoshino等17汇总了 NAD+的两个中间体预防和治疗与年龄相关的生理衰退和疾病的相关实例，发现NAD+中间体与哺乳动物衰老和长寿控制机理有关。NMN 和 NR 逐渐成为医药保健等领域研究的热点，具有广阔的应用前景。目前 NMN 和 NR 在日本和美国已作为营养补充剂的原料进入抗衰老领域市场，价格十分昂贵19。但在我国 NMN 和 NR 尚未取得相关许可，膳食摄入仍是其主要获取途径，寻找NMN 和 NR 良好的天然食物来源也受到了研究者的关注20。NMN、NR、NAM 和 NAD+已被报道存在于多种天然食物来源中，NR 目前仅有乳品中的含量报道，具体情况见表 1。茶叶具有抗衰延老22和改善心血管疾病等一系列特殊保健功能23，这些功效与 NAD+及其 4 个前体化合物的功能具有较大的相似性。NAD+及其 4 个前体化合物极性大，难挥发，易溶于水，难溶于有机溶剂20,24-25，目前已报道的定量方法有液相色谱-紫外法25-26、液相色谱-质谱法7,19-20,24、酶联免疫法8等，主要集中在生物组织、细胞、蔬菜和水果27等基质中，且多为单一化合物含量测定，未见茶叶中 NAD+及其 4 个前体化合物含量同时测定方法研究报道。基于茶叶中 NAD+及其 4 个前体化合物物质微量存在，且茶叶基质复杂，干扰性强，本研究以灵敏度高，抗干扰能力强的超高效液相色谱-串联质谱仪为分析仪器，通过优化样品前处理方法和色谱条件，以绿茶、红茶和黑茶为研究对象，建立同时快速测定茶叶中 NAD+及其 4 个前体化合物的超高效液相色谱-串联218 茶 叶 科 学 43 卷 质谱法（UPLC-MS/MS），测定绿茶、红茶和黑茶中 NAD+及其 4 个前体化合物的含量，并运用主成分分析等比较不同类型茶叶、不同产地茶叶中 5 种目标化合物的成分差异，以期为茶叶营养功效成分揭示和大健康产品研发提供参考。表 1 5 种化合物在天然食物中的含量 Table 1 The amount of 5 compounds in natural foods 类别 Category 名称 Name NMN NR NAD+NA NAM食品 Foodstuff 青豆 0.471.88 mg（每 100 g）14 1.4 mg（每 100 g）21 西兰花 0.251.2 mg（每 100 g）14 0.73 mg（每 100 g）21 黄瓜籽 0.56 mg（每 100 g）14 黄瓜皮 0.65 mg（每 100 g）14 卷心菜 0.00.90 mg（每 100 g）14 0.4 mg（每 100 g）21 鳄梨 0.361.60 mg（每 100 g）14 1.9 mg（每 100 g）21 番茄 0.260.30 mg（每 100 g）14 0.49 mg（每 100 g）21 蘑菇 0.11.01 mg（每 100 g）14 4 mg（每 100 g）21 生牛肉 0.060.42 mg（每 100 g）14 3.17.2 mg（每 100 g）21 虾 0.22 mg（每 100 g）14 0.94.3 mg（每 100 g）21 砖茶 1.9 mg（每 100 g）21 红茶 6.2 mg（每 100 g）21 绿茶 8 mg（每 100 g）21 鲜铁皮石斛 0.093 mg（每 100 g）7 0.33 mg（每 100g）7 乳类8 Dairy products 牛乳 02.4 molL-1 0.53.6 molL-1ND 7.5 molL-1 人乳 2.