产β-葡萄糖苷酶乳酸菌发酵...皮多酚含量和功能活性的影响_覃超.pdf

食品与发酵工业 （）：引用格式：覃超，唐富豪，滕建文，等 产 葡萄糖苷酶乳酸菌发酵对百香果皮多酚含量和功能活性的影响 食品与发酵工业，（）：，（）：产 葡萄糖苷酶乳酸菌发酵对百香果皮多酚含量和功能活性的影响覃超，唐富豪，滕建文，韦保耀，黄丽，夏宁（广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁，）摘 要 紫色百香果皮富含多酚及糖苷结合型黄酮。已有研究证明乳酸菌发酵可释放水果结合多酚，但产葡萄糖苷酶乳酸菌的乳酸发酵是否更有利于释放结合型多酚尚未证实。该文采用 株产酶与 株非产酶乳酸菌分别发酵百香果皮。结果显示，株乳酸菌发酵均可提高百香果皮浆中的多酚含量，而 株产酶比非产酶乳酸菌发酵释放游离酚能力分别提高了 倍和 倍，且与酶活性密切相关。相应地，其抗氧化和消化酶抑制能力均得到显著提高（），产糖苷酶乳酸菌发酵百香果皮后的消化酶抑制能力显著强于不产酶乳酸菌发酵。该研究结果表明，产 葡萄糖苷酶乳酸菌发酵是提高百香果皮中酚类化合物生物活性的一种很有前景的方法，可能更有利于结合酚向游离酚转化，提高总酚含量，并发挥更高功能活性。关键词 百香果皮；葡萄糖苷酶；乳酸发酵；多酚；抗氧化活性；消化酶抑制第一作者：硕士研究生（滕建文教授为通信作者，：）基金项目：南宁市科技计划项目；南宁市尖兵食品科技有限公司合作项目收稿日期：，改回日期：百香果皮作为百香果加工后产生的副产物，是生物活性化合物的丰富来源，因为果皮中含有大量的功能性化合物，尤其是酚类化合物。等研究发现紫百香果皮乙醇提取物中含有 种酚类物质，并发现百香果皮中牧荆素、木犀草素和槲皮素等苷元类黄酮具有消化酶抑制能力。紫皮百香果皮中含有丰富的以木犀草素、芹菜素、白杨素、槲皮素等为苷元的黄酮碳苷和氧苷类物质。而研究表明百香果皮中结合酚含量占比较高，且果皮结合酚中黄酮类和酚酸类物质更丰富。相比游离酚，结合酚不易被人体胃肠道消化吸收，且抗氧化能力弱于前者，而水解产生的糖苷往往表现出更高的抗氧化能力。因此促进结合酚的释放，糖苷类黄酮转化为苷元是提高果皮酚类化合物生物活性的有效途径。乳酸菌（，）发酵最早用于延长食品保质期和改善风味，对活性成分生物转化及提取的特性被逐渐挖掘，如通过代谢转化多酚物质提高抗氧化活性。等使用几种乳酸菌发酵苹果汁，结果表明一些酚类物质（没食子酸、表儿茶素和根皮苷）的含量显著增加，发酵苹果汁的抗氧化能力也得到改善。黄梅华等用植物乳杆菌发酵火龙果皮，观察到总黄酮含量增加并且提高了抗氧化能力。尽管已有许多研究证明乳酸菌发酵会改变酚类物质，提高总酚含量，但对于这一变化原因多推测为乳酸菌的生物降解作用或酸水解反应将聚合酚类物质转化成更多简单酚类物质，或是由于微生物生长过程代谢的纤维素酶、木质素分解酶和果胶酶等的作用。葡萄糖苷酶（）作为一种纤维素水解酶，通过去糖基化过程参与酚类化合物的水解，破坏其与碳水化合物之间的化学键，将糖苷类黄酮转化为较高活性的苷元形式，这种转化利于提高基质的多酚含量和功能特性。如高产 葡萄糖苷酶乳酸菌发酵增强了猕猴桃底物的功能，添加到面包后增强了其抗氧化和风味特征。关于乳菌酸发酵果蔬基质提高其功能活性的研究已有报道，然而具有产 葡萄糖苷酶能力的乳酸菌发酵对基质的酚类含量和功能活性的影响研究仍旧有限。因此，本文以富含酚类化合物的百香果皮为发酵基质，对比产糖苷酶和非产糖苷酶乳酸菌发酵对果皮酚类含量、抗氧化和抑制消化酶能力的影响，评估是否具有产糖苷酶能力的乳酸菌发酵更有利于酚类物质的释放和功能活性的增强。材料与方法 菌株与试剂戊糖乳杆菌（，编号：）、戊 糖 乳 杆 菌 （编 号：）和戊糖片球菌（）研究报告 年第 卷第 期（总第 期）（编号：），株菌保藏于本实验室，其中、产葡萄糖苷酶，不产。七叶苷，美国 公司；对硝基苯酚（，），成都艾科达化学试剂有限公司；自由基溶液，东京化成工业株式会社；葡萄糖苷酶、淀粉酶、对硝基苯酚 葡萄糖苷（，），上海源叶生物科技有限公司；对硝基苯葡萄糖苷，上海麦克林生物科技有限公司。仪器与设备 计，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；细菌培养箱，上海施都凯仪器设备有限公司；离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；酶标仪，瑞士 公司。实验方法 乳酸菌发酵百香果皮浆 株菌活化后经 液体培养基扩大培养至生长对数中期，取菌悬液于、离心 收集菌泥，使用无菌生理盐水洗涤 次后再次离心，取菌沉淀溶于无菌水中制成发酵种子液（值约为）。将新鲜百香果皮洗净、擦干后切条，与水以质量比 打浆至无大颗粒存在，加入 （质量分数）白糖和（质量分数）脱脂乳粉混匀。使用柠檬酸和小苏打调节浆液 值至 ，然后分装于广口瓶中。灭菌（，），冷却后接入 发酵种子液在 下无氧发酵，并在、分别取样测定。葡萄糖苷酶活性测定参考 等的方法对粗酶液提取方法稍作修改。取 发酵液，在 、下离心 后收集沉淀，用磷酸钠缓冲液（、）清洗后再重复离心 次得到细胞沉淀。使用上述缓冲液调节其 值约为，然后在细胞破碎仪中低温破碎（超声，间歇，超声功率，循环次），得到粗酶液。粗酶液在磷酸钠缓冲液中与 溶液反应后，测定 处吸光值，并以加热失去活性的酶液（、）作为空白对照。以 浓度（）为横坐标，吸光值为纵坐标做标准曲线，得到回归方程 ，相关系数 。酶活力定义为每毫升粗酶液在 、条件下每分钟分解 产生 的活力。其计算如公式（）所示：（）式中：，葡萄糖苷酶活力，；，总反应体系体积，；，粗酶液稀释倍数；，粗酶液体积，；，反应时间，；，吸光值带入标曲得到的 浓度，。多酚含量测定将发酵不同时间段百香果皮浆冻干后研磨成粉末状，放置干燥皿中以待提取。参照 等的方法对酚类提取处理稍作修改并测定多酚含量。游离酚的提取：取 百香果皮粉于 离心管中，加入 冷丙酮（丙酮）（甲酸），在冰浴下超声提取 后离心 （、）。收集离心后的上清液，并将残余物重复提取 次。合并上清液，并在 下旋蒸。使用（体积分数）的甲醇将旋干物复溶至 ，得到游离酚提取液，置于 保存。结合酚的提取：向游离酚提取后的残余物中加入 （），充入氮气后密封。室温下振荡 ，用（）调节至 。在 、下离心 后收集上清液，用乙酸乙酯（体积比，）萃取滤液 次。收集合并乙酸乙酯相并在 下旋蒸直至除去乙酸乙酯后，使用 的甲醇将其定容至 ，得到结合酚提取液，置于 保存。含量的测定：采用 法测定酚含量，以没食子酸为标准品绘制标准曲线。含量以每克样品干基中所含没食子酸（，）当量的毫克数（）表示。总酚含量计为游离酚与结合酚含量之和。乳酸菌总数测定参照 中乳酸菌的计数方法。值与总酸（，）测定用 计直接测定果 皮 浆 值。参 考 测定发酵过程中的总酸含量。抗氧化活性测定 阳 离 子 自 由 基 清 除 能 力：参 照 等的方法略加修改，以 样品和 阳离子自由基溶液反应测定。清除率计算如公式（）所示：清除率 样空（）式中：样、空分别表示样品、空白对照组反应后的值。食品与发酵工业 （）自由基清除能力和还原能力的测定参照 等的方法测定，清除率计算同公式（）。消化酶抑制能力测定样品处理：参考 等的方法稍作修改。取 发酵各阶段冻干果皮粉，用 （体积分数）乙醇水溶液浸提 后，、下离心，重复提取沉淀后合并上清液，在 条件下旋干乙醇后用超纯水定容至 ，得到 的果皮样品提取液。随后稀释成不同浓度的待测液以测消化酶抑制率。葡萄糖苷酶抑制：取 的磷酸钠缓冲液（）、待测液和 对硝基苯酚葡萄糖苷溶液（）在 孔板中混匀 反应。再加入 葡萄糖苷酶，反应 后，加入 的终止反应，于 处测定吸光度。以缓冲液作为空白对照组。抑制率按公式（）计算，样品 淀粉酶抑制能力用 值表示。抑制率 样空（）式中：样、空分别表示样品、空白对照组的 值。淀粉酶抑制：将 待测液与 淀粉酶溶液（）混合。水浴 后，加入 淀粉溶液，在 水浴中再反应，用 ，二硝基水杨酸（）溶液终止反应，在 处测量吸光度。以超纯水作为空白对照组。抑制率按公式（）计算，样品 淀粉酶抑制能力用 值表示。数据分析所有数据点均为至少 个独立实验的“平均值 标准偏差”。和 整理实验数据，分析 水平的差异显著性，在 水平进行 相关性分析，由 软件绘图。结果与分析 发酵过程中果皮浆理化指标的变化 值和 是表征菌株生长和发酵程度的重要指标。发酵开始后，组发酵浆的 值快速下降至 左右，总酸含量和菌落总数显著升高，表明乳酸菌利用百香果皮浆中的糖分生长并产生有机酸，菌株对百香果皮浆底物具有良好的适应性（图）。发酵 时，组果皮浆的 值稳定（），大量积累（），菌落数达到 。不同样品的 个指标无显著差异，为分析多酚含量和功能活性提供了一致的基质环境。值与；菌落总数图 接种乳酸菌发酵后百香果皮浆 值、总酸含量及菌落总数变化 ，发酵过程中酶活力的变化为阐明 葡萄糖苷酶对百香果皮浆酚类含量变化的影响，对发酵过程中 葡萄糖苷酶活力进行测定。如表 所示，发酵过程中，和 发酵组的 葡萄糖苷酶活力呈现同样的变化趋势（先增后减），且均在 时达到最大值（）、（），随着发酵继续，糖苷酶活力开始下降。其中 在发酵过程中表现出更高的酶活力，且酶活力规律与菌落总数变化规律相似，这与 等的研究结果一致。发酵 后菌落总数虽短期升高，但增长速率已经减缓，菌株的菌落总数则呈降低趋势（图）。可能是此时高酸环境抑制了菌体的生长与代谢活动，从而影响产酶活动，使得 时成为酶活力拐点。在哈尔滨乳杆菌 和戊糖片球菌发酵猕猴桃实验中，发现类似的 葡萄糖苷酶活性变化，但酶活力拐点出现在 。另一方面，有研究指出来自植物乳杆菌的 葡萄糖苷酶在 时表现出最高活性，而在 时仅保持约 的活性。尽管尚未有研究指出来自戊糖乳杆菌的 葡萄糖苷酶的最适 值，但高酸的抑制效果不容忽视。因此发研究报告 年第 卷第 期（总第 期）酵液 的 总 酸 持 续 升 高，可 能 也 是 酶 活 性 受 到抑制的因素。表 乳酸菌发酵百香果皮浆过程中的 葡萄糖苷酶酶活力单位：发酵时间 注：不同上标字母代表显著性差异（）发酵过程中多酚含量的变化如图 所示，各发酵组的游离酚含量为上升趋势，结合酚与总酚含量呈先减后增，并最终表现为增加。发酵结束时，高产酶组的游离酚和总酚含量（）、（）均高于低产酶组（）、（），且均远远高于 非产酶组（）、（）。结合酚含量在降至同一水平后，高 产 酶 组 表 现 出 更 高 的 增 加 量，而 低产酶组和非产酶组的含量变化类似。众所周知，简单的酚酸和类黄酮通常以共轭（糖苷）和结合形式出现，然而，酚酸可以通过酯或醚键与其他细胞壁组分连接，可以通过在室温下碱性水解酯键。在发酵后期，结合酚和总酚含量增加，这与许多研究结果相似，推测其原因可能是乳酸菌产生的酶会削弱结合的酚类物质和细胞壁组分之间的醚键，这使得结合酚更容易被提取。另一方面，在发酵过程中存在酶水解以释放酚类化合物，这有助于游离酚含量的显著增加。可能单一酶对结合酚转化的效力有限，导致发酵果皮中残留了大量的结合酚类物质。图 表明乳酸发酵改变了百香果皮浆中游离酚与结合酚含量比例，且 葡萄糖苷酶的存在利于游离酚含量占比的提高。百香果皮中多酚主要以共价键的形式与细胞壁的结构成分（纤维素、阿拉伯糖、木聚糖、木质素和果胶）相连接，形成不溶的结合态多酚。这与香蕉皮（）和橙子皮（）的不可提取多酚含量占比相近，高于苹果皮（）和梨皮（），因此结合酚向游离酚的转化具有巨大潜力。、发酵组的结合酚含量与酶活力呈显著负相关（）（图）。葡萄糖苷酶通过弱化结合态多酚与细胞壁组间的共价键，从植物细胞壁中释放出可溶的共轭或不溶的结合酚类，为转化为游离酚提供机会。游离酚；结合酚；总酚；产 葡萄糖苷酶的戊糖乳杆菌 发酵；产 葡萄糖苷酶的戊糖乳杆菌 发酵；非产酶戊糖片球菌 发酵图 乳酸菌发酵过程中百香果皮浆的多酚含量及组成变化 此外，乳酸发酵积累大量乳酸，降低了果皮浆的 值，更利于酚类物质的可提取性，表现为 值、与游离酚含量呈显著相关（，图）。值作为酚类提取的重要参数已在苹果中得到验证，即食品与发酵工业 （）调整 值从 降至 时，苹果多酚的提取率增长了近。图 中总酚含量降低可能是发酵过程中酚类物质流动、大聚合酚类物质的形成及小酚类物质降解造成。且福林酚法测定酚类含量易受到一些还原剂