UHPLC-Q-Orbit...青过程中呈味核苷酸变化分析_黄艳.pdf

茶叶科学 2023，43（2）：227236 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期：2022-11-24 修订日期：2023-01-23 基金项目：福建省自然科学基金（2019J01413）作者简介：黄艳，女，讲师，主要从事茶叶加工与品质研究。*通信作者：； UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 测定乌龙茶中呈味核苷酸及 铁观音做青过程中呈味核苷酸变化分析 黄艳1,2，周孝森1,3，高晨曦2，张灵枝2，荣杰峰4*，孙威江2*1.福建农林大学安溪茶学院，福建 泉州 362400；2.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；3.中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；4.泉州海关综合技术服务中心，福建 泉州 362000 摘要：核苷酸是茶叶中核酸和咖啡碱生物合成的重要底物，也是茶汤中重要的鲜味物质之一。建立了一种超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）测定核苷酸含量的分析方法，可在 4 min 内测定茶叶中胞苷-5-单磷酸（CMP）、尿苷-5-单磷酸（UMP）、腺苷-5-单磷酸（AMP）、肌苷-5-单磷酸（IMP）和鸟苷-5-单磷酸（GMP）等 5 种呈味核苷酸，并分析这 5 种核苷酸在铁观音做青过程中含量的变化规律。结果表明，5 种核苷酸的检出限为 0.871.47 gg-1，定量限为 2.624.41 gg-1，线性范围为 501 000 ngmL-1，日内精密度和日间精密度分别为 2.17%4.17%和 2.95%4.74%，回收率为 72.89%91.98%；铁观音茶树品种可检测出 UMP、CMP 和 AMP 3 种核苷酸，含量分别为 16.9826.78、14.3117.56、7.809.91 gg-1，由高到低依次为 UMP、CMP、AMP，CMP 在做青后期缓慢增加；呈味核苷酸总量变化范围为 40.7856.69 gg-1，呈现稳定性波动。该方法快速准确、灵敏度高、稳定性和精密度好，可为茶叶加工过程中风味化学物质分析的研究提供技术支持。关键词：铁观音；鲜味；做青；呈味核苷酸 中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1000-369X(2023)02-227-10 Determination of Flavored Nucleotides in Oolong Tea by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry and Changes of Flavored Nucleotides in the Making Green Process of Tieguanyin Tea HUANG Yan1,2,ZHOU Xiaosen1,3,GAO Chenxi2,ZHANG Lingzhi2,RONG Jiefeng4*,SUN Weijiang2*1.Anxi College of Tea Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Quanzhou 362400,China;2.College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;3.Tea Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310008,China;4.Quanzhou Customs Comprehensive Technology Service Center,Quanzhou 362000,China Abstract:Nucleotide is a kind of important substrate for the biosynthesis of nucleic acid and caffeine in tea,which is DOI:10.13305/ki.jts.2023.02.008228 茶 叶 科 学 43 卷 also one of the most important umami substances in tea infusion.Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry was used for the determination of nucleotide contents.Five types of flavored nucleotides including cytidine 5-monophosphate(CMP),uridine 5-monophosphate(UMP),adenosine 5-monophosphate(AMP),inosine 5-monophosphate(IMP)and guanosine 5-monophosphate(GMP)in tea were determined within 4 min,and dynamic changes of the above nucleotide contents in the making green process of Tieguanyin Oolong tea were analyzed.The results show that the detection limits of the five nucleotides were 0.87-1.47 gg-1,with the limits of quantification of 2.62-4.41 gg-1 and a linear range of 50-1 000 ngmL-1.The intra-day and inter-day precisions were 2.17%-4.17%and 2.95%-4.74%,with a recovery rate of 72.89%-91.98%.Three types of nucleotides,AMP,CMP and UMP,were detected in tea cultivar Tieguanyin,with the UMP content of 16.98-26.78 gg-1,the CMP content of 14.31-17.56 gg-1,and the AMP content of 7.80-9.91 gg-1.The UMP,CMP,and AMP in Tieguanyin were ranked in order from high to low and the CMP content increased slowly in late stages of making green process.The total amount of flavored nucleotides in the making green process varied from 40.78 to 56.69 gg-1,showing the trend of mild and stable fluctuation.The method is rapid,accurate and sensitive with high stability and precision,which can be used as an analytical technique for the study of flavor chemistry in tea processing.Keywords:Tieguanyin,umami taste,making green,flavored nucleotide 核苷酸是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位，是生物体核酸合成的前体物质，也是人体健康所需的必要成分1。食品中的鲜味化合物除了以谷氨酸钠为代表的氨基酸类、肽胺、肽等化合物以外，还包括 5-核苷酸。核苷酸的核糖上有 3 个自由基团，通过与磷酸缩合作用产生 5-核苷酸、3-核苷酸和 2-核苷酸等 3 种不同的核苷酸异构体，只有磷酸基连接在 5-碳原子上且磷酸基中 2 个羧基解离，才能产生肌苷-5-单磷酸（IMP）、鸟苷-5-单磷酸（GMP）、胞苷-5-单磷酸（CMP）、尿苷-5-单磷酸（UMP）等鲜味核苷酸类化合物，其中 IMP 和 GMP 为主的核苷酸类2-4是主要的鲜味核苷酸。此外，核苷酸能与氨基酸产生协同效应，提高食品风味5-7。鲜味是 5 种基本味觉（咸、甜、苦、酸、鲜）之一，具有调节食欲、预防慢性疾病和减少脂肪摄取8等功效。鲜味是茶叶中重要的风味属性，研究茶叶中呈鲜味核苷酸的特征，对分析茶叶的品质和保健功效具有重要的科学价值。呈味核苷酸能够提高茶叶风味，调味茶通过添加呈味核苷酸增加风味9；适当添加IMP 和 GMP，能降低表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallatecatechin gallate，EGCG）的涩味，提高回甘生津的效果4；呈味核苷酸也能提高白茶茶汤的醇厚度10。作为闽南乌龙茶的代表，清香型铁观音鲜度特征凸显，拥有与绿茶类似的鲜爽品质。摇晾结合的做青工序是形成鲜味的关键环节，较少研究从乌龙茶的加工风味化学层面，探讨做青过程中游离态核苷酸的变化与茶汤鲜味的关系。现有定量分析核苷、核苷酸和碱基的检测方法主要包括毛细管电泳法11、液相色谱法12-16、离子交换高效液相色谱法17、荧光定量高效液相色谱法18、液相色谱-质谱联用法19-21、亲水色谱-高分辨率质谱联用法22-23等。离子交换色谱法因高盐流动相的使用，无法与质谱联用25；毛细管电泳法测定数据可靠、灵敏度高，但操作复杂且成本高。茶叶中游离核苷酸含量低、次生代谢产物的干扰因素多，分析技术难度较大，单纯的液相色谱分析准确性不高，与高分辨质谱联用，保证定性色谱峰和定量检测同时进行，可缩短分析时间、提高色谱峰的分辨率和灵敏度23，适用于以茶叶为代表的复杂基质中多种核苷酸类化合物检测。本研究建立了超高效液相色谱-四极2 期 黄艳，等：UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 测定乌龙茶中呈味核苷酸及铁观音 229 杆/静电场轨道阱高分辨质谱法（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）测定茶叶中游离核苷酸含量的分析方法，并探讨乌龙茶做青过程中呈味核苷酸的动态变化，旨在为乌龙茶加工风味化学研究提供理论参考。1 材料与方法材料与方法 1.1 试验仪器 Q-Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统、Vanquish UHPLC 超高效液相色谱系统，美国 Thermo Scientific 公司；NBS-U410 型超低温冰箱，青岛海尔股份有限公司；ALPHA1-4 LD plus 型真空冷冻干燥机，德国 Christ 公司；电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；Vortex2 涡旋振荡仪，德国 IKA 仪器设备有限公司；BDP-20TJ 型超纯水机，南京权坤生物科技有限公司；HWS-24 型恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；SC-3610 型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；UC-7600 超声波机，深圳佳源达科技有限公司；Acquity UPLC C18色谱柱（2.1 mm100 mm，1.7 m），美国 Waters公司；0.22 m PTFE 针式滤膜，Biosharp 生物科技公司；6CWY-85 摇青机，福建佳友茶叶机械智能科技股份有限公司。1.2 主要试剂与药品 CMP、UMP、IMP、GMP 和腺苷-5-单