储藏时间对肉鸡腿肌脂质氧化...号通路相关抗氧化蛋白的影响_卢倩.pdf

试验研究NO.06 202361饲料研究 FEED RESEARCH储藏时间对肉鸡腿肌脂质氧化状态和Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关抗氧化蛋白的影响卢倩 张欣 万晓莉 胥蕾*（扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009）摘要：试验旨在研究肉鸡腿肌中Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）-核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路相关抗氧化蛋白和脂质氧化状态的潜在作用时间。随机选取42日龄的健康AA肉鸡6只，每只鸡为1个重复，共6个重复。每只鸡取同一块腿肌样品随机分为5个处理，分别对应5个储存时间，即0、1、2、4、7 d。结果显示，在4 的储藏条件下，屠宰后1、2、4、7 d肉鸡腿肌中丙二醛（MDA）含量显著高于0 d（P0.05）；屠宰后4 d，肉鸡腿肌中过氧化氢（H2O2）含量显著高于0、2 d（P0.05）；屠宰后1 d肉鸡腿肌中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性显著高于0、2 d（P0.05）。研究表明，4 储藏条件下，肉鸡屠宰后抗氧化作用在01 d最强，Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关蛋白和抗氧化酶的潜在作用时间可达7 d。关键词：储藏时间；肌肉；脂质氧化；抗氧化；Keap1/Nrf2-ARE中图分类号：S 831 文献标识码：A 文章编号：1002-2813（2023）06-0061-05 Doi：10.13557/ki.issn1002-2813.2023.06.013Effect of storage time on pattern of changes of lipid oxidation and Keap1/Nrf2-ARE signaling pathway-related antioxidant proteins in broiler leg muscleLU Qian ZHANG Xin WAN Xiao-li XU LeiAbstract:The study was to investigate the potential time of action of Keap1-Nrf2/ARE signaling pathway related antioxidant proteins and lipid oxidation status in broiler leg muscle.Six 42-day-old healthy AA broilers were randomly selected,with one replicate for each chicken and a total of six replicates.The same leg muscle samples were taken from each chicken and randomly divided into five treatments corresponding to five storage times,namely 0,1,2,4 and 7 d.The results showed that at 4,the content of MDA in leg muscle of broilers at 1,2,4 and 7 d after slaughter was significantly higher than that at 0 d(P0.05).The content of H2O2 in leg muscle of broilers on 4 d after slaughter was significantly higher than that on 0,2 d(P0.05).The activity of GSH-Px in leg muscle of broilers on 1 d was significantly higher than that on 0,2 d(P0.05).The experiment indicates that the antioxidant effect of broilers is strongest at 0 to 1 d after slaughter at 4,and the potential action time of Keap1/Nrf2-ARE signaling pathway related proteins and antioxidant enzymes can reach 7 d.Key words:storage time;muscle;lipid oxidation;antioxidation;Keap1/Nrf2-ARE肉鸡产业是我国主要畜禽产业之一，2021年全国肉鸡总出栏量比2020年增加了7.41。肉鸡产量增加的同时也要严格要求肉品质。肉鸡在被屠宰后体内的抗氧化能力降低，因此抗氧化酶无法快速清除有氧代谢产生的自由基，活性氧（ROS）自由基不断累积并攻击细胞，导致机体脂质氧化程度加深，肉品质下降2-3。脂质氧化的增强可促进蛋白质氧化，破坏蛋白质结构导致肉品质下降，如变色、变味和营养价值损失等，影响禽肉的货架期和经济效益4-5。生产中可通过添加抗氧化剂，如维生素E、益生菌和天然植物提取物等提高肉鸡抗氧化能力和肉品质6-8。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）-核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通第一作者：卢倩，硕士在读，研究方向为家禽营养与生产。通信作者：胥蕾，博士，副教授，硕士生导师。基金项目：国家自然科学基金项目（项目编号：31601978），国家自然科学基金项目（项目编号：31802095）收稿日期：2022-08-31试验研究NO.06 202362饲料研究 FEED RESEARCH路是肉鸡体内经典的抗氧化调节通路，在氧化应激条件下可以调节相关抗氧化蛋白的表达，对抵御外界的损伤和自身抗氧化防御具有重要意义9。本课题组前期研究表明，屠宰前适宜的电流和气体致晕方法可以调节Keap1/Nrf2-ARE通路，发挥延长鸡肉货架期的作用2,10。肉鸡屠宰后，基因和蛋白会快速降解。研究表明，添加抗氧化剂可以调节Keap1/Nrf2-ARE信号通路的表达，从而提高动物的抗氧化能力11。但目前，关于Keap1/Nrf2-ARE通路在屠宰后的潜在作用时间及添加抗氧化剂对屠宰后的作用时间未见报道。因此，本试验研究4 储藏温度下，肉鸡屠宰后脂质氧化状态和Keap1/Nrf2-ARE信号通路关键分蛋白的变化规律，探索Keap1/Nrf2-ARE信号通路在屠宰后的潜在作用时间，为屠宰前通过营养调控技术改善肉鸡肉品质、延长货架期提供参考。1材料与方法1.1试验设计随机选取42日龄的健康AA肉鸡6只，每只鸡为1个重复，颈动静脉放血致死。每只鸡取同一块腿肌样品随机分为5个处理，分别对应5个储存时间，即0、1、2、4、7 d。0 d组取样后立即-20 冻存；其余4组于4 条件下分别储藏 1、2、4、7 d，每组 3 份，其中 1 份于-20 冻存，以检测氧化和抗氧化的相关含量；此外两份于-80 冻存，用以检测Keap1/Nrf2-ARE信号通路中相关蛋白和抗氧化酶活性。1.2试验材料考马斯亮蓝、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽硫基转移酶（GST）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液（强）（P0013B）、PMSF抑制蛋白酶（ST506）均购自上海碧云天生物有限责任公司。1，1二苯基2三硝基苯肼（DPPH）购自东京化成工业株式会社。1.3测定指标及方法1.3.1氧化与抗氧化酶准确称量1.00 g肉鸡样品（-20）置于10 mL离心管中，加入4 mL生理盐水，低温（4）使用多样品快速匀浆机（Tiss-96，上海净信实业发展有限公司），得到20匀浆液，2 500 r/min（4）离心20 min，取上清液-20 保存。MDA、H2O2、GSH-Px、GST、T-AOC及总蛋白含量检测方法参考试剂盒说明书。1.3.2DPPH自由基清除能力DPPH自由基清除能力的测定参照张欣等2的方法稍作修改，肌肉匀浆稀释至10后与0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液按照 13 混匀，避光室温反应 30 min，低温（4）3 500 r/min离心10 min，取上清液于517 nm处测定吸光度值（A样品）。使用不同质量浓度的Trolox溶液与DPPH乙醇溶液按照13混匀，制作标准曲线，横坐标为不同质量浓度的Trolox溶液，纵坐标为吸光度值，得到标准曲线为y=-2.768x+0.612 5，R2=0.990 2，计算DPPH自由基清除能力。肌肉匀浆液清除DPPH能力=(A样品吸光度-b)/(a样品蛋白含量)(1)式中：b为标准曲线中x的系数，b=-2.768；a为标准曲线中常数项，a=0.612 5。1.3.3Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关蛋白表达量检测取-80 保存的肉鸡腿肌样品40 mg快速充分剪碎，放入2 mL离心管中，加入400 L含PMSF的RIPA裂解液，冰上匀浆后4、2 500 r/min离心20 min，使用移液枪将匀浆上清液分装成2份。根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，检测总蛋白浓度，采用鸡Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）ELISA检测试剂盒、鸡核因子E2相关因子（Nrf2 ELISA 检测试剂盒、鸡血红素氧合酶 1（HO-1）ELISA 检测试剂盒和鸡谷胱甘肽硫基转移酶（GST）ELISA检测试剂盒测定肉鸡腿肌中Keap1、Nrf2、OH-1和GST蛋白含量，ELISA蛋白检测试剂盒均购自武汉默瑞斯生物科技有限公司，检测方法参考说明书。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行整理，SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，Duncans 法进行多重比较。结果以“平均值和标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同储藏时间对肉鸡腿肌脂质氧化产物、抗氧化能力和酶活性的影响2.1.1不同储藏时间对肉鸡腿肌脂质氧化产物的影响（见表1）由表1可知，在4 的储藏条件下，屠宰后0 d，肉鸡腿肌中 MDA 含量显著低于 1、2、4、7 d（P0.05）。宰 后 4 d，肉 鸡 腿 肌 中 H2O2含 量 显 著 高 于 0、2 d（P0.05）。在4 储藏条件下，屠宰后肉鸡腿肌中H2O2含量与储藏时间具有一次线性关系（P0.05）。表1不同储藏时间对肉鸡腿肌的脂质氧化状态的影响 项目0 d1 d2 d4 d7 d标准误P值组间线性MDA/(mol/g prot)0.46a1.09b0.90b0.82b0.84b0.060.0040.137H2O2/(mmol/g prot)1.57a2.29ab2.09a3.41b2.61ab0.200.0360.016注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下表同。试验研究NO.06 202363饲料研究 FEED RESEARCH2.1.2不同储藏时间变化对肉鸡腿肌抗氧化能力和酶活性的影响（见表2）由表2可知，宰后1 d肉鸡腿肌中GSH-Px活性最高，显著高于宰后0、2 d（P0.05）。在4 储藏条件下，宰后肉鸡腿肌中DPPH清除能力与储藏时间具有一次线性关系（P0.05）。3讨论3.1肉鸡屠宰后储藏时间对腿肌脂质氧化产物、抗氧化能力和酶活性的影响正常生理活动中，少量ROS可参与机体的免疫过程，但当抗氧化系统被破坏后，多不饱和脂肪酸（PUFA）与过量的ROS反应产生的氧化产物可造成细胞损伤12-13。一些氧化产物，如MDA可以间接反映机体脂质氧化程度12-15。OH、H2O2、O2-等活性氧可作用于蛋白质，使氨基酸残基发生氧化，导致蛋白质构象改变而变性，甚至丧失蛋白质功能15-16。本试验表明，在4 储