蛋白磷酸酶2A在氯化镉致小...及β淀粉样蛋白沉积中的作用_岑育芳.pdf

论著基础研究基金项目：国家自然科学基金（）；广西自然科学基金（）；广西硕士研究生创新项目（）第一作者简介：岑育芳，在读硕士研究生，公卫医师，研究方向：分子毒理学。通信作者简介：庞雅琴，博士，教授，研究方向：分子毒理学。蛋白磷酸酶 在氯化镉致小鼠海马神经元细胞 蛋白过度磷酸化及 淀粉样蛋白沉积中的作用岑育芳，杨玲玲 李文学 漆光紫，王一涵 韦俊宏，唐玉航 庞雅琴，（右江民族医学院基础医学院，广西百色市；广西高校生态铝工业基地环境与人群健康研究重点实验室，广西百色市；右江民族医学院“环境污染与健康风险评价”重点实验室，广西百色市；广东省广州市疾病预防控制中心毒理与生化检验科，广东省广州市；右江民族医学院 公共卫生与管理学院，医学检验学院，广西百色市）【摘要】目的 探讨蛋白磷酸酶（）在氯化镉致小鼠海马神经元 细胞 蛋白过度磷酸化及 淀粉样蛋白（）沉积中的作用。方法采用不同浓度（、）氯化镉对 细胞进行染毒，采用 法测定细胞活力，以筛选后续实验的染毒浓度。将 细胞分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，分别给予 、氯化镉染毒，后在倒置显微镜下观察细胞形态，并采用 检测细胞中 淀粉样蛋白前体（）、蛋白、磷酸化 蛋白（）、蛋白、蛋白、蛋白表达水平。结果（）染毒 后，与经 氯化镉染毒后的细胞相比，经不同浓度氯化镉染毒后的细胞活力均下降（均 ）。选择细胞存活率为 左右的氯化镉浓度作为后续实验最高染毒浓度。（）染毒 后，镜下观察发现对照组细胞呈梭形，不同剂量组细胞呈梭形及多边形；与对照组相比，不同剂量组细胞间隙逐渐增宽，且在高剂量组中可见少量漂浮细胞。与对照组相比，低剂量组、中剂量组 细胞的 蛋白表达水平升高，中剂量组、高剂量组 细胞的 和 蛋白表达水平升高，各剂量组 蛋白表达水平均降低，高剂量组、蛋白表达水平下降（均 ）。结论 镉可能通过下调 亚基的表达，以诱导小鼠海马神经元细胞 蛋白过度磷酸化和 生成，进而产生神经毒性。【关键词】镉暴露；神经毒性；氯化镉；蛋白磷酸酶；蛋白；淀粉样蛋白；小鼠海马神经元细胞【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）：，（，；，；，；，；，）【】（）（）（，）广西医学 年 月第 卷第 期 ，（），（），（），（）（），（），【】，镉是一种有毒、非必需的过渡金属，主要来源于火山活动、森林火灾及人为排放。环境中的镉通过职业接触、饮食、吸烟等方式进入人体，可在软组织中长期蓄积，并引起免疫系统、内分泌系统、生殖系统病变。流行病学研究表明，血镉不仅与认知水平呈负相关，还与阿尔茨海默病（，）患者的死亡风险显著关联。两大病理特征包括由 淀粉样蛋白（，）在细胞外沉积组成的神经炎性斑和由过度磷酸化 蛋白胞内丝状聚集体组成的神经纤维缠结。有学者采用镉对 淀粉样蛋白前体（，）转基因小鼠进行染毒，发现镉可加速脑组织神经元 的沉积，使 含量增加。镉还通过阻断 受体、上调糖原合酶激酶、增加总 蛋白和磷酸化 蛋白水平，进而诱导胆碱能神经元细胞死亡。但镉致 沉积及 蛋白过度磷酸化的机制尚未阐明。蛋白磷酸酶（，）是真核细胞中主要的一种酶，在所有哺乳动物细胞中普遍表达，占细胞总蛋白的 ，能将蛋白质的丝氨酸 苏氨酸残基去磷酸化，在调节大多数细胞复制、转录、翻译、细胞周期、细胞转化等功能中发挥重要作用。可调节人脑中多个基因位点的磷酸化，可引起约 蛋白的去磷酸化。研究表明，患者的大脑皮层和海马中 的表达和活性总体降低。而 在镉诱导 蛋白过度磷酸化及 沉积中是否发挥作用有待进一步的研究。因此，本研究采用氯化镉作用于小鼠海马神经元 细胞，探讨 参与氯化镉致小鼠海马神经元细胞 蛋白异常磷酸化及 沉积的调控机制。材料与方法 材料 细胞株：小鼠海马神经元细胞系 细胞由广州市疾病预防控制中心毒理与生化检验科李文学主任医师惠赠。试剂与仪器：结晶氯化镉（，广州化学试剂厂，批号：）；、胎牛血清、青霉素链霉素（公司，批号：、）；蛋白酶抑制剂、磷酸蛋白酶抑制剂（公司，批号：、）；（公司，批号：）；蛋白抗体、蛋白抗体、磷酸化 蛋白 （，）抗体（公司，批号：、）；蛋白抗体、蛋白抗体、蛋白抗体（公司，批号：、）；蛋白抗体（，批号：）；山羊抗兔（）、二喹啉甲酸蛋白检测盒、细胞裂解液、试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：、）；制胶试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司，批号：）。恒温培养箱、酶标仪（型号：）、孔板、孔板、细胞培养 ，皿（公司）；钟摆摇床（武汉塞维尔生物科技有限公司）；电泳仪、转膜仪（公司）；显影仪（公司）；高速冷冻离心机（公司）；倒置显微镜（公司）。实验方法 细胞培养：细胞使用含 胎牛血清、青霉素链霉素的（完全培养基），并置于、培养箱培养。当细胞密度达到 时传代，传代前使用 清洗培养瓶 次，次，然后使用胰酶消化细胞 ，并轻轻摇晃细胞瓶加速细胞脱落，室温下以 离心 ，使用完全培养基重悬细胞后，继续传代培养。氯化镉储备液的配置：称取氯化镉 ，置于 离心管，加入高压后的超纯水定容至，配制成 的母液，稀释 倍得到 储备液，使用滤膜（孔径为 ）对储备液进行抽滤，常温储存。法检测细胞活力：将生长状态良好且融合度达 的细胞收集到 离心管中，室温下以 离心，后以完全培养基重悬细胞，以 个 的密度种于 孔板中，孔，置于、培养箱培养 后，换成含有不同浓度氯化镉（终浓度分别为 、）的完全培养基，置于 、培养箱培养 后弃去培养基，使用 洗涤细胞次，次，每孔加入 的 试剂和 完全培养基，在 、培养箱中培养 后在酶标仪上 波长处测定吸光度值，并计算细胞存活率。存活率 （染毒组吸光度 空白孔吸光度）（对照组吸光度 空白孔吸光度），其中对照组为加入 氯化镉的细胞，空白孔不加任何物质，空白孔检测值作为背景值。每组设 个平行孔，实验重复 次。实验分组及染毒：根据 法检测结果，将细胞分为对照组、低剂量组（氯化镉）、中剂量组（氯化镉）、高剂量组（氯化镉）进行实验。将生长状态良好且融合度达 的细胞收集到 离心管中，室温下以 离心 后以完全培养基重悬细胞，以 个 的密度种于 细胞培养皿，皿，在 、培养箱中培养 后，在对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞培养皿分别加入、氯化镉储备液，在、培养箱中培养 后观察细胞形态并提取蛋白进行后续实验。每组设 个平行孔，实验重复 次。蛋白提取及定量：取染毒 后的各组细胞，弃去培养基，使用 洗涤细胞 次，次，使用细胞刮收集细胞至 管，下以 离心 ，弃上清液。加入提前混有蛋白酶抑制剂、磷酸蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上放置，每 用涡旋混匀器震荡 次，促进细胞裂解，后于 下以 离心 ，取上清液。根据二喹啉甲酸试剂盒使用说明进行总蛋白定量，将各样品蛋白调整至相同浓度后，将蛋白与 上样缓冲液以 比例震荡混匀，恒温金属加热器中 煮 。将制备完成的样品放入 冰箱中保存。检测相关蛋白表达水平：根据制胶试剂盒使用说明进行制胶，每孔加入 的总蛋白进行电泳（），湿转膜法将蛋白转移至 膜上，使用脱脂牛奶封闭 膜、洗涤，剪裁后敷上一抗（蛋白抗体、蛋白抗体、抗体、蛋白抗体、蛋白抗体、蛋白抗体、蛋白抗体，稀释比例均为 ），在 摇床上过夜。第 天取出 膜并回收一抗，使用 缓冲液（含）洗涤 膜 次，次，加入山羊抗兔（）（）孵育 ，弃二抗，缓冲液洗涤 膜 次，次，显影。使用 软件对图片进行分析。统计学分析 采用 软件进行统计分析。计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 检验。以 表示差异具有统计学意义。结 果 不同浓度氯化镉对 细胞活力的影响 染毒 后，与经 氯化镉染毒后的细胞相比，经不同浓度氯化镉染毒后的细胞活力均下降（均 ）。与经 氯化镉染毒后的细胞相比，经 、氯化镉染毒后的细胞活力均下降（均 ）；与经 氯化镉染毒后的细胞相比，经 、氯化镉染毒后的细胞活力均降低（均 ）；与经 氯化镉染毒后的细胞相比，经 、氯化镉染毒的细胞活力广西医学 年 月第 卷第 期均下降（均 ），且经 、氯化镉染毒后的细胞活力过低（平均细胞存活率低于）。本实验选择细胞存活率为 左右的氯化镉浓度作为后续实验最高染毒浓度，因此后续实验低、中、高氯化镉染毒剂量分别为 、。见表。不同浓度氯化镉对 细胞形态的影响 染毒 后，镜下观察发现对照组细胞呈梭形，不同剂量组细胞呈梭形及多边形。与对照组相比，不同剂量组细胞间隙逐渐增宽，且在高剂量组中可见少量漂浮细胞。见图。表 不同浓度氯化镉对 细胞活力的影响（）氯化镉浓度细胞存活率（）值 值 注：与 比较，；与 比较，；与 比较，；与 比较，。图 组 细胞的形态（）不同浓度氯化镉对 细胞 蛋白及 水平的影响 染毒 后，与对照组相比，低剂量组、中剂量组 细胞的 蛋白表达水平升高，中剂量组、高剂量组 细胞的 表达水平升高（均 ）；与低剂量组比较，中剂量组、高剂量组 细胞的 表达水平升高（均 ）。见表、图。表 组 细胞 蛋白及 相对表达水平（）组别 蛋白对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 值 值 注：与对照组比较，；与低剂量组比较，。图 组 细胞 蛋白及 表达情况 不同浓度氯化镉染毒对 细胞 蛋白表达水平的影响与对照组相比，中剂量组、高剂量组 蛋白表达水平升高（均 ）。见表、图。表 组 细胞 蛋白相对表达水平的比较（）组别 蛋白对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 值 值 注：与对照组比较，。图 组 细胞 蛋白表达情况 不同浓度氯化镉染毒对 细胞 亚基蛋白表达水平的影响与对照组相比，高剂量组 蛋白、蛋白表达水平下降，低剂量组、中剂量组、高剂量组 蛋白表达水平均降低（均 ），见表、图。表 组 细胞 亚基蛋白相对表达水平的比较（）组别 蛋白 蛋白 蛋白对照组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 值 值 注：与对照组比较，。，图 组 细胞 亚基蛋白表达情况 讨 论 镉可通过不同途径进入神经系统：当镉颗粒随空气进入鼻腔后，其经鼻黏膜被嗅觉感觉神经元吸收，再经嗅觉感觉神经元转运至嗅球并蓄积；经口摄入的镉进入血液循环后可引起星形胶质细胞及内皮细胞紧密连接的改变，从而增加血脑屏障通透性，促使血液中的镉滤过增多并在中枢神经系统中蓄积，从而影响神经系统的多种功能。临床研究表明，镉暴露可能是 等神经退行性疾病的病因，镉穿过血脑屏障后导致中枢神经系统功能障碍，症状包括嗅觉功能障碍、帕金森样症状、血管舒缩功能减慢，以及注意力、学习和记忆的神经缺陷。动物实验显示，孕期、哺乳期镉暴露可增加雄性子代成年鼠海马的 淀粉样斑块蓄积。是型跨膜蛋白，在中枢神经系统广泛表达，在神经发育过程中发挥着重要的作用。在裂解酶作用下依次裂解成不同长度的 单体，其中 神经毒性更高，与 患者神经元死亡和认知功能障碍直接相关。本实验采用氯化镉对小鼠海马神经元 细胞进行染毒，结果提示中、高剂量氯化镉染毒后 细胞的 蛋白表达升高，这表明一定剂量的镉暴露引起神经毒性的机制可能与其可诱导 蛋白表达升高有关。在家族性 患者中，蛋白大量沉积及 蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结和神经元死亡同时存在，最终发展为认知功能障碍症状，甚至痴呆。蛋白在微管相关蛋白中含量最高，正常生理状态时，蛋白与微管蛋白结合促进其聚合形成微管，维持微管稳定性，并诱导成束。神经元内的 蛋白可在超过 个丝氨酸和苏氨酸残基处磷酸化，但这些残基的过度磷酸化可以抑制 蛋白与微管结合，并在神经元内以神经纤维缠结的形式聚集，最终使微管网络中断。针对 基因缺失小鼠的研究表明，基因缺失会导致衰老相关的短期记忆缺陷、多动和突触可塑性缺陷，而来自 基因缺失小鼠的胚胎海马神经元细胞表现出轴突生长和神经元成熟的显著延迟，表明 蛋白不仅对神经元成熟具有重要作用，并且在学习、记忆和突触可塑性中起着关键作用。多个研究表明，蛋白过度磷酸化是 的早期表现。等的研究显示，镉暴露可诱导胆碱能神经元、总 蛋白和磷酸化 蛋白的产生。本研究结果也提示一定剂量的氯化镉可诱导 细胞的 蛋白及 表达水平升高，提示镉暴露引起神经毒性的机制可能与其可诱导磷酸化 蛋白表达水平升高有关。正常生理状态下，蛋白磷酸化与去磷酸化保持动态平衡，蛋白磷酸化程度受体内多种特异蛋白激酶和磷酸酶的活性平衡情况的影响。因此 磷酸酶和激