艾根多糖的结构特征及免疫活性研究_马盖凡.pdf

基金项目国家自然科学基金联合基金（编号：）作者简介马盖凡，硕士研究生，研究方向：中药化学。通信作者孟燕，博士，副教授，研究方向：中药新制剂；陈林霖，博士，研究员，研究方向：中药药效物质基础及作用机制。艾根多糖的结构特征及免疫活性研究马盖凡，姜雪莲，孟燕，陈林霖，（湖北中医药大学中药资源与中药复方教育部重点实验室，湖北 武汉 ；湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 ；湖北蕲艾产业技术研究院有限公司，湖北 黄冈 ）摘要目的：艾根为种植艾叶（）药材的副产品，富含黄酮和多糖，在民间常用作滋补食材，但其药用和保健价值未受重视。方法：该研究利用水提醇沉法提取分离得到艾根多糖（），采用高效凝胶渗透色谱、和红外光谱初步解析其结构。法检测 对脾淋巴细胞增殖的影响；中性红吞噬实验测定 细胞吞噬能力，测定一氧化氮（）、肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）及 的水平；采用环磷酰胺免疫抑制小鼠模型评价其体内免疫活性；最后通过 自由基（）、羟自由基（）、超氧阴离子（）自由基清除能力及 、总抗氧化能力实验评价其抗氧化活性。结果：结果表明 主成分分子量为 ，由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸（摩尔比 ）和微量的木糖组成。该多糖在 浓度范围内能显著促进脾淋巴细胞的增殖，提高巨噬细胞的吞噬能力及、的释放；并可明显逆转环磷酰胺所致小鼠体重减轻，恢复器官指数和碳廓清能力；且对、和 自由基有不同程度的清除能力。结论：该研究揭示了艾根多糖的基本结构并证实其具有优异的免疫调节及抗氧化活性，可为艾蒿植物资源利用和功能性产品的开发提供理论参考。关键词艾根多糖；提取分离；免疫调节；抗氧化 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，；，；，）：，（），（），（），（）（）（），（），（）（，），（），：；近年来，多糖因其来源广泛，结构与活性多样，毒副作用小而成为天然药物、膳食补充剂和化妆品原料研究的热点，。临床上天然植物多糖多用作免疫调节剂，如香菇多糖注射液、黄芪多糖注射液及云芝多糖等，同放化疗配合应用，可以在一定程度的增强机体免疫力，减轻不良反应。此外，在化妆品领域，已有多种植物多糖被列入化妆品原料，如燕麦葡聚糖、芦荟多糖、晚香玉多糖等。中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，艾（）为菊科蒿属草本植物，应用历史悠久，神农本草经、名医别录、本草纲目 等医籍中均有记载。艾叶为其主要药用部位，为中医妇科常用药，亦可制成“艾绒”供灸用，已收载于中国药典。艾根为种植艾叶药材的副产品，民间常用作滋补品来煲汤，植物资源丰富，但该部位的药用和食疗价值尚未得到充分认识和开发，需要进行深入研究。研究发现艾叶多糖对非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有显著增强，能抑制小鼠 移植瘤的生长，以及乳腺癌、胃癌等肿瘤细胞的体外增殖，还是一种良好的天然抗氧化剂和抗衰老候选成分，然而艾蒿中其他部位活性成分尚未见报道，。作者前期研究发现艾根富含多糖类成分，具有较好的应用前景和开发价值，因此本研究对从艾根中提取得到的多糖的理化性质及单糖组成进行分析，并利用动物和细胞模型评价其免疫调节及抗氧化活性，以期为艾蒿植物资源利用和功能性产品的开发提供理论参考。材料 仪器 十万分之一天平（瑞士梅特勒公司）；高效液相色谱仪（美国赛默飞公司）；蒸发光散射检测器 （美国 公司）；冷冻干燥机（东京理化器械株式会社）；超纯水系统（英国 公司）；傅里叶变换红外光谱仪（美国赛默飞公司）；全波长酶标仪（美谷分子仪器有限公司）。药材与试剂艾根采自湖北省蕲春县，经湖北中医药大学陈林霖研究员鉴定为菊科植物艾的干燥根。葡萄糖（批号 ，上海实验试剂有限公司）；葡 萄 糖 醛 酸（批 号 ，阿 法 埃 莎 公司）；（）半乳糖（批号 ），（）甘露糖（批 号 ），半 乳 糖 醛 酸（批 号 ），鼠李糖（批号 ），（）阿拉 伯 糖（批 号 ），（）木 糖（批 号 ）和（）果糖（批号 ）均购自上海泰坦 科 技 股 份 有 限 公 司；葡 聚 糖 标 准 品 （批号 ）、（批号 ）购自上海源叶生物科技有限公司，测定试剂盒（）购自上海碧云天生物技术有限公司；（批号 ）、（批 号 ）及 （批 号 ）试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司。动物 级雄性昆明小鼠 只，周龄，体质量 ，购自湖北省医学实验动物中心，许可证号 （鄂）。动 物 于 温 度 ，相对湿度 ，昼夜循环环境下适应性饲养周。方法 艾根多糖的提取和纯化艾根于 烘干至恒重，粉碎得到艾根粗粉。取 艾根粗粉以 乙醇渗漉去除小分子物质后得到艾根渣。艾根渣室温干燥后以 倍 热水浸提次，每次 ，过滤，合并滤液，减压浓缩至原体积约 即得艾根粗多糖浓缩液。艾根粗 多 糖 浓 缩 液 置 分 液 漏 斗 加 入 等 体 积 试剂（氯仿正丁醇 ）充分混匀 后分离上清液，重复脱蛋白操作步骤共次后，加入乙醇至终浓度不低于，搅匀后于 静置过夜，收集沉淀物以无水乙醇洗涤后加入适量蒸馏水溶解，以截止分子量 的透析袋透析以除尽小分子物质，于 弱碱性阴离子交换树脂脱色，用蒸馏水 的流速洗脱直至硫酸蒽酮检测无明显颜色变化，收集洗脱液减压浓缩至小体积，冻干，即得艾根多糖（）。的理化性质参照文献 分别采用蒽酮硫酸法测定总糖含量，间羟基联苯法测定糖醛酸。多糖分子量测定采用高效凝胶渗透色谱联用蒸发光散射检测器（）分析：色谱柱 （，），流动相为超纯水，流速 ，柱温 ，进样量；漂移管温度 ，载气流速 。以已测定 的葡聚糖对照品（、）保留时间为横坐标（），为纵坐标（），获得葡聚糖对照品回归方程，代入 主要色谱峰的保留时间（）计算。单糖组成测定 混合单糖对照品的配制精确称取葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖和果糖对照品各 ，溶于 蒸馏水中，配制成 标准溶液。不完全酸水解精确称取 加入 三 氟 乙 酸（），封 管 于 水解 ，氮吹，通过加入甲醇反复吹干除去过量 ，样品吹干后加入 水溶解，离心 后经 检测。完全酸水解精确称取 加入中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，封管于 条件下水解 ，水解完成后，加入适量甲醇旋蒸浓缩，除尽残留的 ，加入 蒸馏水溶解。衍生化参照文献 采用 柱前衍生化 法测定单糖成分及其摩尔比。取单糖标准溶液和水解多糖样品溶液各 与 甲醇溶液（）混合，加入 氢氧化钠溶液 涡旋混匀，水浴 反 应 ，冷 却 至 室 温 后 加 入 盐酸溶液中和，以倍体积三氯甲烷萃取次除去残留的试 剂，取 上 层水相 加入 蒸馏水稀释混匀，经 微孔滤膜滤过后检测。样品检测果糖检测条件：（，），柱温 ，流 动 相 甲 酸 水乙 腈（：），流 速 ，进样量。漂移管温度 ；载气流速 。检测条件：取衍生化后的对照品和样品溶液各进 检测，色谱条件为色谱柱为 （，）；流动相为乙腈 乙酸铵水溶液（），流速 ，柱温，检测波长 。的红外光谱（）分析称取干燥的 样品适量，与 粉末按 置于玛瑙研钵中研磨均匀，压片，在 的范围内进行 扫描。的免疫调节活性研究 溶 液 的 配 制精 密 称 取 ，加入 的无菌 溶解后，配制成浓度为 的样品母液，灭菌后鲎试剂检测热原，将母液进一步稀释得到 ，和 的样品溶液。对小鼠脾细胞增殖的影响 小鼠脱颈椎处死，乙醇浸泡 ，于超净台中取出脾脏，无菌 洗涤，碾碎，过 目细胞筛，离心 ，用含 的 培养基制备成脾细胞悬液接种在 孔培养板上，密度为 个毫升，每孔 。设空白对照组（无菌 ）、给药组（）、阳性对照组（，），每组个复孔，置于 培养箱中 培养 。每孔加入 ，继续培养 ，酶标仪上于 处测定吸光度。增值率的计算公式如下：增值率（测定空白）空白 对 细胞的毒性将处于生长对数期的 细胞配置成均匀的细胞悬液，按 个毫升的密度转移到 孔板中，将细胞置于 培养箱中待细胞完全贴壁后，每孔加入“”项 下 不 同 浓 度 溶 液（），每个浓度个复孔，空白对照组加入等体积无菌 溶液，置于 培养箱中继续培养 ，然后每孔加入 溶液，继续培养 后，在 波长下测定吸光度。法测定 细 胞 活 力 的 计 算 公 式 如 下：细 胞 活 力（给药组空白组）的中性红吞噬实验 的培养及上板同“”项下，孔板每孔 ，细胞密度调至 个毫升，设空白对照组（无菌 ）、给药组（）、阳性对照组（，），每组个复孔，细胞在培养箱中孵育 后，弃去上清，每孔加入 中性红 ，继续培养 ，弃去上清，以 孔洗遍，加入冰乙酸无水乙醇（，）裂解过夜，于 测定吸光度。吞噬率的测定公式如下：吞噬率（样空）空 。对 巨 噬 细 胞 释 放的 影 响 培养同“”项下，按“”项下分组加入样品溶液，空白对照组和阳性对照组分别 加 入 等 体 积 的 无 菌 和 ，继 续 培 育 ，收集细胞上清，按试剂盒操作，使用酶标仪 下测定吸光度。对巨噬细胞分泌 、及 的影响同“”项下，按 试剂盒操作，使用酶标仪 下测定吸光度。碳廓清实验将 只小鼠随机分为组，每组只，即对照组、模型组、和 低、高剂量组。低、高剂量组每日分别按 ，灌胃，连续 ，对照组和模型组每日灌胃等体积生理盐水。低、高剂量组及模型组在第，腹腔注射环磷酰胺 ，正常组注射等体积生理盐水，末次给药后，小鼠禁食，自由饮水，称重。末次腹腔注射后，小鼠尾静脉注射稀释倍的印度墨汁后立即计时，于第，小鼠眼底静脉丛取血，立刻加入 溶液中，在 处测吸光度，计算清除指数。处死小鼠取肝脏、脾脏及胸腺称重，计算脾指数、胸腺指数及吞噬指 数。计 算 公 式 如 下：（）（），脾指数脾重体重，胸腺指数中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，胸腺重体重，体重（脾重肝重）。抗氧化活性考察 清除能力的测定参照文献 并优化，配制 的 乙醇溶液，溶液稀释成，的不同浓度，混匀后避光反应 ，酶标仪于 下测定吸光度，作为阳性对照，平行测次取平均值，计 算公式为：清除率（样空白）对照 ，样为 乙醇溶液与不同浓度多糖样品的吸光度值，空白为乙醇与不同浓度多糖样品的吸光度，对照为无水乙醇与 乙醇溶液的吸光度。羟自由基（）清除能力的测定粗多糖溶液的配制同“”项下，蒸馏水作为空白对照，作为阳 性 对 照，按 照 羟 自 由 基 测 定 试 剂 盒 操 作，下测定吸光度值，样本平行测次取平均值，计算公式为：抑制率（对照空白）对照 。超氧阴离子（）清除能力测定同“”项下配制粗多糖溶液，蒸馏水作为空白对照，作为阳性对照，按照超氧阴离子自由基测定试剂盒操作，下测定吸光度，样本平行测次取平均值，计算公式为：抑制率对照测定）对照 。自由基清除能力测定同“”项下配制粗多糖溶液，蒸馏水为空白，溶液为阳性 对 照，按照 自由 基测定 试 剂 盒 操 作，下测定吸光度，样本平行测次取平均值，抗 氧 化 能 力 以 （）表示。铁离子还原抗氧化能力（）测定同“”项下配制粗多糖溶液，蒸馏水为空白，为阳性 对照，按 照 自由 基 测定试 剂 盒 操 作，下测定吸光度值，样本平行测 次取平均值，抗氧化能力以 标准溶液的浓度表示。统 计 学 处 理验 数 据 由 平 均 值 标 准 差（）表示，组间比较则采用单因素方差分析（），认为有显著性差异，应用 进行数据处理并作图。结果 的分离纯化艾根通过热水提取后脱蛋白、醇 沉、脱 色、冻 干 后 得 到 ，得 率 为 （以干艾根计），其中总糖含量为 ，糖醛酸含量为 。的结构分析 的分子量测定经 法测定 色谱峰的保留时间，根据标准葡聚糖线性回归方程为.（.）计算分子量。如图所示，至少由种 分 子 质 量 的 多 糖 组 成，主 成 分 由 保 留 时 间 ，重均分子质量为 的多糖构成，另有一分子量偏低的多糖因未达到基本分离无法准确测定分子量。图 的 色谱图 的单糖组成和比例如图、所示，不完全水解产物中未检测到果糖，表明其中不含果糖。经与标准单糖对照品保留时间比较，艾根中的多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和微量的木糖组成，摩尔比为 。果糖对照品（）；不完全水解液（）；单糖混合对照品溶液（）；完 全 水 解 液（）；甘露糖（）；鼠李糖（）；葡萄糖醛酸（）；半乳糖醛酸（）；葡萄糖（）；半乳糖（）；木糖（）；阿拉伯糖（）图 的单糖组成 色