靶向RNA的CRISPR-Cas系统研究进展_洪甜.pdf

洪甜 等/靶向 RNA 的 CRISPR-Cas 系统研究进展 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1363-1373 DOI:10.13345/j.cjb.220633 2023 Chin J Biotech,All rights reserved *Corresponding author.E-mail:hong_ Received:2022-08-10;Accepted:2022-10-17;Published online:2022-10-19 1363 生物工程学报 靶向 RNA 的 CRISPR-Cas 系统研究进展 洪甜1*，罗庆华2 1 西藏大学医学院，西藏 拉萨 850000 2 四川大学华西医院，四川 成都 610044 洪甜,罗庆华.靶向 RNA 的 CRISPR-Cas 系统研究进展J.生物工程学报,2023,39(4):1363-1373.HONG Tian,LUO Qinghua.Advances in the RNA-targeting CRISPR-Cas systemsJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1363-1373.摘 要：CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR associated proteins)系统是细菌和古细菌抵抗噬菌体、质粒等外源遗传物质的一种适应性免疫系统，该系统利用一种特殊的 RNA(CRISPR RNA,crRNA)指导的内切酶来切割与 crRNA 相互补的外源遗传物质，从而阻碍外源核酸的侵染。根据效应复合物组成形式的不同，CRISPR-Cas 系统分为 1 类(型、型和型)和 2 类(型、型和型)两大类。目前已发现多个 CRISPR-Cas 系统具有非常强的特异靶向 RNA 编辑能力，如型 CRISPR-Cas13 系统和型 CRISPR-Cas7-11 系统。随着研究的深入，相关系统在 RNA 编辑领域应用日渐广泛，使其成为基因编辑的有力工具。本文介绍了靶向RNA 的 CRISPR-Cas 系统的组成、结构、分子机制以及其潜在应用，这为更好地研究该类系统的作用机制奠定基础，也为后期开发为稳定的基因编辑工具提供新的思路。关键词：CRISPR-Cas 系统；基因编辑；Cas13；Cas7-11 Advances in the RNA-targeting CRISPR-Cas systems HONG Tian1*,LUO Qinghua2 1 School of Medicine,Tibet University,Lhasa 850000,Tibet,China 2 West China Hospital of Sichuan University,Chengdu 610044,Sichuan,China Abstract:The CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR associated proteins)system is an adaptive immune system of bacteria and archaea against phages,plasmids and other exogenous genetic materials.The system uses a special RNA(CRISPR RNA,crRNA)guided endonuclease to cut the exogenous genetic materials complementary to crRNA,thus blocking the infection of exogenous nucleic acid.According to the composition of the effector complex,CRISPR-Cas system can be divided into two 综 述 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1364 categories:class 1(including type,and)and class 2(including type,and).Several CRISPR-Cas systems have been found to have very strong ability to specifically target RNA editing,such as type CRISPR-Cas13 system and type CRISPR-Cas7-11 system.Recently,several systems have been widely used in the field of RNA editing,making them a powerful tool for gene editing.Understanding the composition,structure,molecular mechanism and potential application of RNA-targeting CRISPR-Cas systems will facilitate the mechanistic research of this system and provide new ideas for developing gene editing tools.Keywords:CRISPR-Cas system;gene editing;Cas13;Cas7-11 CRISPR-Cas 系统是细菌长期进化过程中抵御噬菌体入侵和外源质粒转移而形成的一种获得性免疫系统1-3。该系统的发现最早可追溯至 1987 年，日本的 Ishino4团队在大肠埃希菌的碱性磷酸酶基因中观察到一个 29 bp 的重复序列。这一发现在当时并没有引起人们的关注，但随后更多的研究发现在细菌和古细菌中广泛存在这种重复序列。直到 2002 年将其正式命名为规律成簇间隔短回文序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)5-7。目前研究表明，自然界中的 CRISPR-Cas 系统根据效应复合物的组成形式不同，可将其分为1 类和 2 类两大类8-12：1 类 CRISPR-Cas 系统利用多 Cas 蛋白效应物复合物来识别和切割靶标核酸，包括、和型；2 类 CRISPR-Cas系统利用单个较大的 Cas 蛋白发挥作用，包括、和型13(图 1)。其中，靶向 RNA 的系统是 2 类中的型和 1 类中的型系统，型CRISPR-Cas 系统有 AD 四个亚型，而型CRISPR-Cas 系统包括 AF 六个亚型14。尽管DNA 靶向系统已经发展成为一套强大的遗传修饰工具，但靶向 RNA 的 CRISPR-Cas 系统近几年才作为可编程的工具出现15-16。作为新开发的 RNA 敲除和编辑工具，由Cas13 蛋白和 crRNA 组成的 2 类型效应器已占据领先地位17-18。然而，Cas13 系统在多种细胞类型中观察到显著毒性和脱靶效应19。因此，迫切需要更好地能够靶向 RNA 的单效应器CRISPR-Cas 系统。2019 年，-E 型 CRISPR-Cas系统被发现10。随后，两项研究确定了-E 型CRISPR-Cas 系统的特征，分别被 zcan 等称为Cas7-1120，被 van Beljouw 等称为巨型重复相关的神秘蛋白(gaint repeat associated mysterious protein,gRAMP)21，并证明了它们作为高度特异、可编程、一体化 RNA 靶向系统的适用性。本文简介了靶向 RNA 的 CRISPR-Cas 系统的最新研究进展，将 cas13 蛋白和 Cas7-11 蛋白作为RNA 编辑工具进行比较(表 1)，并从结构的角度分别阐述它们特异性识别并处理 pre-crRNA以及靶向切割 RNA 的分子机制；另外，还对它们在基因编辑领域的潜在应用进行了分析。1 Cas7-11 和 Cas13 系统简介 1.1 Cas7-11 和 Cas13 的发现 2015 年，美国 Eugene Koonin 实验室和张锋团队合作，利用计算生物学方法在微生物宏基因组数据库中发现了 Cas13a(也被称为 C2c2)系统22，并从这种计算方法中得到启示，CRISPR-Cas 基因位点中 cas1 和 cas2 基因的存在并非必不可少，这使得他们设计了一个新的计算方法，在 2017 年发现了 Cas13b 系统，即-B 型系统23-24。2018 年，通过进一步改进以前的计算方法，并将搜索范围扩大到更小的效应物而发现了 Cas13d 系统。Cas13d 的大小约 洪甜 等/靶向 RNA 的 CRISPR-Cas 系统研究进展 ：010-64807509： 1365 图 1 CRISPR-Cas 系统分类 Figure 1 Classification of the CRISPR-Cas system.*:The representative effector protein of this system.表 1 Cas13 和 Cas7-11 蛋白作为 RNA 编辑工具的特点比较 Table 1 Comparison of the characteristics of proteins Cas13 and Cas7-11 as RNA editing tools Editing efficiency Escribed activity Cytotoxicity Delivery efficiency Cas13 High Common,will cause serious off-target effect Common Cas13X has the smallest molecular weight and high delivery efficiency Cas7-11 High None None High molecular weight and high delivery efficiency for modified protein 为 930 个氨基酸，是目前发现的较小的型CRISPR-Cas 效应物24-25。2021 年，杨辉研究组报道了目前最小的 RNA 编辑工具 Cas13X 系统(仅 775 个氨基酸)，2022 年该课题组在此基础上进一步开发出了具有高效编辑活性但极低旁切活性的高保真Cas13X蛋白变体hfCas13X，其将在基于 RNA 编辑的基因治疗领域展现出巨大的应用潜力26。2021 年，美国麻省理工学院的 Omar O.Abudayyeh 及 Jonathan S.Gootenberg 实验室通过大量筛选细菌基因组序列，将-E 亚型系统的集合扩大到 17 个基因座。与传统的多组分效应蛋白复合物不同，这个独特的-E 型系统由Cas7 和 Cas11 融合形成单一的效应蛋白，即Cas7-1120。同年荷兰代尔夫特理工大学的 Stan J J Brouns 团队也报道了该类型的 CRISPR-Cas系统，该团队将其称为 gRAMP21。该系统的独特之处在于 Cas7-11 能将 pre-crRNA 加工为成熟的 crRNA，而这被普遍认为是第二大类CRISPR 系统的特征之一。1.2 组成和结构 所有的 Cas13 蛋白都是由 crRNA 和具有两个独立的催化位点的