m6A甲基化对邻苯二甲酸单...小鼠睾丸间质细胞自噬的作用_马慧颖.pdf

宁夏医科大学学报45卷邻苯二甲酸酯类化合物（phthalic acid esters，PAEs）作为增塑剂，常被用在儿童玩具、食品外包装和医疗器械等产品的生产过程中1。在对中国23 个城市水源中邻苯二甲酸酯类物质浓度进行检测时发现，邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯 di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP 的检出率高达87.9%2。在生物体内，DEHP 经过一系列酶促反应形成活性代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（mono-2-ethylhexyl phthalate，MEHP），MEHP具有生殖和发育毒性等3，其在生物组织中蓄积时间长达 6 个月，因此 MEHP 的毒性评估不容忽视4。在哺乳动物细胞中，自噬是一种非常保守的机制，自噬可介导受损的细胞成分向溶酶体传递以维持体内平衡5。本课题组前期研究发现，MEHP染毒能够诱导胞质内产生自噬体6。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核细胞中最丰富的 RNA 甲基化形式，研究7表明，m6A 甲基化在精子发生和胚胎发育中起到了重要的调控作用，m6A 去甲基化酶可影响小鼠睾丸精子的生成8，m6A 甲基化酶缺失导致精子发生相关基因的改变，从而使精原细胞收稿日期：2022-08-03基金项目：宁夏自然科学基金项目（2021AAC03163）；2021 年宁夏医科大学优势学科群建设项目；宁夏医科大学校级科研基金项目（XM2020008）作者简介：马慧颖（1996），女，在读硕士研究生，研究方向：卫生毒理学。E-mail：通信作者：李玲，女，教授，硕士研究生导师，研究方向：环境有害因素与健康。E-mail：m6A 甲基化对邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯诱导小鼠睾丸间质细胞自噬的作用马慧颖1，李玲1，2，3，郭晓英1，德小明1，2，3，李丽萍1，2，3，郝羽1，闫凤梅1（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川750004；2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川750004；3.生育力保持教育部重点实验室，银川750004）摘要：目的探讨邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯 mono（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP 致小鼠睾丸间质（TM-3）细胞自噬中 m6A 甲基化的作用。方法将对数生长期的 TM-3 细胞暴露于浓度梯度（0、5、10、20、40、80 mol L-1）的 m6A 甲基化抑制剂 3-脱氮腺苷（3-Deazaadenosine，DAA）24 h，CCK-8 法检测细胞活力，确定3-脱氮腺苷的染毒剂量后，梯度稀释为对照组（0 mol L-1）、MEHP 低剂量组（200 mol L-1）、MEHP 中剂量组（400 mol L-1）、MEHP 高剂量组（800 mol L-1），将 TM-3 细胞分别暴露于 0、200、400、800 molL-1MEHP，40 molL-1DAA+400 mol L-1MEHP 和 40 mol L-1DAA 染毒组 24 h，光镜下观察 TM-3 细胞形态。CCK-8 法检测细胞存活率；m6A RNA 甲基化定量检测试剂盒检测 m6A 修饰水平；丹酰尸胺（MDC）荧光染色检测自噬形成情况；Western blot 检测 LC3-、LC3-/LC3-和 Beclin-1 的蛋白表达水平。结果与对照组相比，DAA 浓度为 5、10、20、40 mol L-1时，细胞活力均无明显变化（P 均0.05）；DAA 浓度为 80 mol L-1时，细胞活力下降（P0.01）；各 MEHP 染毒组 TM-3 细胞活力和 m6A 甲基化水平均降低（P 均0.01），细胞空隙变大，圆形细胞增多，贴壁细胞的数量明显减少；DAA 组 m6A 甲基化水平较对照组降低（P0.01）；与 MEHP 中剂量组相比，DAA+MEHP 组细胞活力和 m6A 甲基化水平均下降（P 均0.01），细胞发生皱缩，细胞间隔稍有增大。与对照组相比，各 MEHP 染毒组、DAA+MEHP 组和 DAA 处理组 LC3-的蛋白表达水平均升高（P 均0.05），MEHP 低剂量组 MDC 荧光信号强度、LC3-/LC3-和 Beclin-1 的蛋白表达量均无明显变化（P 均0.05）；MEHP 中、高剂量组和 DAA+MEHP 组荧光强度、LC3-/LC3-和 Beclin-1 的表达量均升高（P均0.01）；DAA 组荧光强度和 Beclin-1 的表达水平均升高（P 均0.01），LC3-/LC3-无明显变化（P 均0.05）。DAA+MEHP 组荧光强度和 LC3-/LC3-较 MEHP 中剂量组呈上升趋势（P0.05）。结论MEHP 可能通过降低 RNA 甲基化 m6A 修饰的水平来诱导 TM-3 细胞发生自噬。关键词：m6A 甲基化；邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯；小鼠睾丸间质细胞；自噬中图分类号：R698文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.004文章编号：1674-6309（2023）03-0236-07论著第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University2363期分化等功能无法正常进行9。本实验通过加入甲基化抑制剂 3-脱氮腺苷（3-deoxyioden osine，DAA）观察 m6A 甲基化在 MEHP 致小鼠睾丸间质细胞自噬中的作用，为进一步研究 m6A 甲基化在 PAEs中致雄性生殖毒性的作用提供理论依据和研究基础。1材料与方法1.1细胞株、主要仪器与试剂1.1.1细胞株小鼠睾丸间质细胞株（TM-3）（中国科学院细胞库）。1.1.2主要仪器CO2培养箱、发光成像系统、超微量紫外分光光度计（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司），康宁细胞计数仪（上海康宁管理有限公司），细胞成像系统倒置生物显微镜（深圳爱可机械有限公司），高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司），多功能酶标仪（美国珀金埃尔默股份有限公司）。1.1.3试剂 MEHP、DMSO溶剂（美国 Sigma公司），DAA（美国 Cayman Chemical 公司），DMEM、双抗、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（上海逍鹏生物科技有限公司），胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司），CCK-8 细胞增殖检测试剂盒（上海贝博生物科技有限公司），总 RNA 提取试剂盒（大连宝生物工程有限公司），m6A RNA 甲基化定量检测试剂盒（艾美捷科技有限公司），全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白检测试剂盒、自噬检测试剂盒、化学发光检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），LC3 和 Beclin-1 抗体（Abcam 公司）。1.2TM-3 细胞培养、染毒液配制及分组复苏 TM-3 细胞，每瓶加入含有 10%胎牛血清、1%双抗的 DMEM 培养基至 4 mL，放置于 37、100%相对湿度、5%CO2的细胞培养箱中，培养2448 h 至细胞铺满培养瓶底 80%，传代 23次，在生长至对数生长期时收集 TM-3 细胞，进行后续相关实验。MEHP 染毒液配制：称取 100 mg MEHP 标准品，加入 1 mL DMSO 将其稀释成浓度为359.27 mmol L-1的 MEHP 溶液，其中 DMSO 终浓度为 0.1%，分装储存于-20 条件下，依照课题组前期实验剂量6，加入无菌培养基，梯度稀释成对照组（0 mol L-1）、MEHP 低剂量组（200 mol L-1）、中剂量组（400 mol L-1）、高剂量组（800 mol L-1）的染毒液，现用现配。DAA 组给予终浓度为 40 mol L-1的 DAA，DAA+MEHP 组给予 40 mol L-1DAA+400 mol L-1MEHP。1.3CCK-8 法检测不同浓度甲基化抑制剂对细胞活力的影响将 TM-3 细胞制成单细胞悬液并进行计数，调整细胞浓度后将细胞接种到 96 孔板中（每孔1104个细胞），在 37、5%CO2和 100%相对湿度的 CO2培养箱中培养 68 h，待细胞贴壁后，加入浓度梯度为 0（DAA 对照组）、5、10、20、40、80 mol L-1的 DAA 继续培养 24 h，避光加入适量的检测液，多功能酶标仪中 37 孵育 0.51 h，检测其吸光度值，计算细胞活力10。1.4光学显微镜下观察 TM-3 细胞形态、CCK-8法检测其存活率将制成单细胞悬液的 TM-3 细胞，按每孔2105个细胞接种到 6 孔板中，待细胞铺满孔底70%80%，分别加入 0、200、400、800 mol L-1的 MEHP，40 mol L-1DAA 和 40 mol L-1DAA+400 mol L-1MEHP 干预 24 h，于光学显微镜下进行观察。加入 CCK-8 检测液在 450 nm波长处检测吸光度值，计算 TM-3 细胞存活率。1.5提取 TM-3 细胞总 RNA 并检测不同组别染毒对 m6A 甲基化水平的影响将处于对数生长期的 TM-3 细胞按每孔 2105个细胞接种到 6 孔板中，待细胞铺满孔板底部 70%80%，每孔加入 2 mL 不同组别的染毒液，继续培养 24 h，按照总 RNA 提取试剂盒说明书操作，提取 TM-3 细胞的总 RNA，随后准备相应数量的 8 联管，使用高效 RNA 结合液将 TM-3细胞总 RNA 结合到孔板上，利用捕捉和检测抗体在多功能酶标仪下检测 450 nm 处的吸光值，并计算 m6A 甲基化水平。m6A（）（ODsample-ODNC）S/（ODPC-ODNC）P 100%，其中 S 为样本 RNA 的质量，P 为阳性对照组 RNA 的质量。1.6丹酰尸胺（MDC）染色检测自噬将 TM-3 细胞以每孔 2104个细胞的浓度接种到 24 孔板中，待细胞铺满孔板底部 80%左右，加入不同组别的染毒液放入培养箱中培养 24 h。洗涤缓冲液洗 2 次，每孔加入 100 L 配制好的MDC 染色液，避光在室温下孵育 2030 min，洗涤缓冲液洗 3 次，荧光显微镜下观察，并对每个组别进行随机拍照，用 Image J 软件分析各组的荧光信号强度。1.7Westernblot检测TM-3细胞相关蛋白表达情况TM-3 细胞经过不同组别染毒 24 h，加入蛋马慧颖，等.m6A 甲基化对邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯诱导小鼠睾丸间质细胞自噬的作用237宁夏医科大学学报45卷白裂解液超声裂解20 min，12 000 r min-1离心5 min，收集上清为 TM-3 细胞的全蛋白，用 BCA试剂盒和多功能酶标仪检测蛋白浓度，配制合适的蛋白上样体系。根据蛋白分子质量进行配胶、电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，1PBST 清洗后，加入相应的一抗稀释液（LC3 为 12 000；Beclin-1 为15 000）放在 4 冰箱孵育过夜，使用洗膜液清洗 3 次，在室温下孵育二抗 12 h，洗膜 30 min后配制 ECL 发光液对目的条带进行曝光。应用Image J 软件对目的蛋白进行灰度值分析。1.8统计学方法采用 GraphPad Prism 9 和 SPSS 26.0 软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用 LSD-t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1不同浓度甲基化抑制剂对 TM-3 细胞活力的影响随着 DAA 浓度的增加，TM-3 细胞活力先增加后降低，当 DAA 浓度为 5、10、20、40 mol L-1时，细胞活性分别为（104.3614.01）%、（101.2611.04）%、（99.24 8.70）%、（97.43 7.49）%，与DAA 对照组相比均无明显变化（P0.05）；当DAA浓度为 80 mol L-1时，细胞活性为（84.945.95）%，较 DAA 对照组降低（