DEHP联合铅慢性染毒对小...能力及APP酶解通路的影响_李奇翰.pdf

54|智慧健康Smart Healthcare2023 年 第 5 期DEHP联合铅慢性染毒对小鼠学习记忆能力及 DEHP联合铅慢性染毒对小鼠学习记忆能力及 APP酶解通路的影响APP酶解通路的影响李奇翰，付朝旭，许妍姬延边大学医学院预防医学教研部，吉林延吉133000摘要：目的 探讨邻苯二甲酸二（2-乙基）乙酯（DEHP）与铅（Pb）慢性联合染毒对小鼠学习记忆能力的影响。方法 将80只2个月龄健康雄性昆明种小鼠作为研究对象，将小鼠随机分为正常对照组（CT）组、b组、DEHP染毒组（低、中、高剂量）和DEHP+Pb联合染毒组（低、中、高剂量）共8组，每组5只。分别在小鼠饲料中染毒DEHP，在饮用水中添加乙酸铅染毒12周和24周。在染毒结束后，进行Morris水迷宫实验检测小鼠行为学改变情况，采取ELISA法测定小鼠脑组织中、-分泌酶活性及sAPP与A1-40含量，并对两种物质的联合作用方式进行评价。结果 Morris水迷宫实验结果显示，与CT组比较，12周与24周的DEHP染毒组随着剂量增加小鼠空间学习能力受到的损害更加严重，可导致空间记忆能力障碍，目标象限路程占总路程百分比降低，目标象限游泳时间缩短，潜伏期增加。生化指标表明，与CT组比较，DEHP组和DEHP联合染毒组随剂量增加，-分泌酶活性、sAPP含量降低，-分泌酶活性、A1-40明显增高，24周小鼠表现比12周小鼠更为明显，高剂量组DEHP与Pb联合染毒表现具有一定的拮抗作用。结论 邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯与铅慢性染毒均会对小鼠学习记忆产生损害，对小鼠引起学习记忆能力障碍，DEHP与铅联合染毒具有一定拮抗作用。关键词：邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯；铅；联合染毒；神经毒性DOI:10.19335/ki.2096-1219.2023.05.013 Effect of DEHP Combined with Chronic Lead Exposure on Learning and Memory Abilities and APP Enzymatic Pathway of MiceLI Qihan,FU Zhaoxu,XU Yanji Preventive Medicine Department,Yanbian University Medicine School,Yanji,Jilin 133000 ABSTRACT：Objective To investigate effect of chronic combined exposure of bis(2-ethyl)phthalate(DEHP)and lead(Pb)on learning and memory abilities of mice.Methods The paper chose 80 2-month-old healthy male Kunming mice as research subjects,and divided them into 8 groups randomly:normal control group(CT),Pb group,DEHP exposure group(low,medium,and high dose),and DEHP+Pb combined exposure group(low,medium,and high dose),with 5 mice in each group.Mice were exposed to DEHP in feed and lead acetate in drinking water for 12 and 24 weeks.After exposure,Morris water maze experiment was conducted to detect behavioral changes of mice,and determine contents of,-secretory enzyme activity and sAPP And A 1-40 contents with ELISA method,combined action mode between two substances was evaluated.Results Morris water maze experiment showed,spatial learning ability of DEHP exposure group at 12 and 24 weeks was more severely impaired as dose increased than CT group,which could lead to spatial memory impairment,decrease in percentage of target quadrant distance in total distance,decrease in target quadrant swimming time,and increase in latency.Biochemical indicators showed that,-secretory enzyme activity,sAPP contents of DEHP group and DEHP combined exposure group lower with dose increase,-secretory enzyme activity,A 1-40 increased more significantly than CT group,performance of mice at 24 weeks was more significant than those at 12 weeks.DEHP and Pb combined exposure of high-dose group had some certain antagonistic effect.Conclusion Both chronic exposure to bis(2-ethylhexyl)phthalate and lead can damage learning and memory of mice,cause impairment of learning and memory abilities.Combined exposure of DEHP 基金项目：本文系吉林省中医药科技项目（项目编号：2018-135）；吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目基金（项目编号：JJKH20200532KJ）|55智慧医疗基础研究and lead has some certain antagonistic effect.KEYWORDS：Bis(2-ethylhexyl)phthalate;Lead;Joint exposure;Neurotoxicity0引言邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）属于邻苯二甲酸酯类（PAEs），常作为增塑剂在塑料制品加工行业中广泛使用。近年来，DEHP被视为一种环境内分泌干扰物（environmental endocrine disruptors,EEDs）而受到关注，因其与塑料分子之间并非以共价化学键形式牢固结合，故极易通过蒸发、洗涤及燃烧等方式从塑料制品中逸出而污染室内空气、食品及饮水等其他物质1-2。人体可以通过呼吸接触、食品摄入、饮水等途径接触DEHP，其中食品摄入为主要暴露原因。有研究提示DEHP可能会影响人体神经、生殖、内分泌、免疫以及肝脏功能并造成损伤3-5。铅（Pb）作为一种易获得、加工简单且价格低廉的热稳定剂，广泛应用于各类塑料制品行业中。随着生活用品需求日益剧增，含铅废物排放日益激增，造成严重的环境污染，并且危害人体健康6，同时，铅暴露可能会造成人体认知能力损伤或影响神经行为改变，长期低水平铅暴露会对人类健康造成极大的伤害7。阿尔茨海默病（alzheimers disease,AD）是以认知行为恶化和记忆力减退为临床表现的神经退行性疾病，早期症状为近事易忘，多疑及睡眠昼夜节律改变；病情发展症状为远、近期记忆受损伴随计算力、定向力及判断力障碍，或并发其他精神症状。由于其病因机制的复杂性和多样性，目前尚无有效干预手段，因此,预防及治疗AD的研究一直受到世界各国的重视。近年来，PAE类物质中的神经毒性引起科学界的注意，而国内关于PAEs的神经毒性作用的信息却十分有限的，缺少涉及PAE类物质的研究。环境化学污染物是流行病和环境毒理学研究重点，DEHP与Pb可能是具有神经毒性的环境污染物8-9，两者都可能是提高AD发病率的潜在因素之一，同时由于增塑剂DEHP与热稳定剂Pb两者在塑料制品生产过程中难以替换，两者已成为环境中普遍存在的持久性污染物，人体往往通过多种途径同时接触两种物质，而目前针对DEHP和Pb联合暴露诱导的神经毒性潜在机制仍不清楚，国内缺少DEHP与Pb联合暴露对神经系统影响的研究，且关于DEHP的研究多为急性毒性实验，因此研究两者慢性低剂量联合染毒毒性作用具有重要意义。故此次实验对染毒DEHP和Pb的小鼠学习记忆能力进行观察，并研究DEHP与Pb慢性低剂量染毒对APP-酶解通路的影响，为老年痴呆症的发病机制和进展提供重要的科学依据。1材料与方法1.1实验试剂与仪器（1）实验试剂：邻苯二甲酸二乙基己酯纯度99.0%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司乙酸铅、（纯度99.0%,天津市化学试剂三厂）、吐温80（纯度99.0%，天津市科密欧化学试剂有限公司）、小鼠-secretase ELISA kit、小鼠-secretase ELISA kit、小鼠可溶性淀粉酶前体蛋白（sAPP）ELISA kit、小鼠A1-40ELISA kit购于上海酶联生物科技。（2）实验仪器：数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器，HH-6）、酶标仪（南京华东电子）、超声波细胞破碎机（上海乔跃电子）、微量振荡器（无锡县金城仪器厂，型号WZS-2A）、SMA RTV3.0行为学视频追踪系统（美国Hayward公司）、Morris水迷宫（上海欣软）、干式恒温器（江苏海门市其林贝尔仪器制造，GL-150B）。1.2实验动物选适龄昆明种雄性小鼠80只2个月龄左右，56|智慧健康Smart Healthcare2023 年 第 5 期初始体重为（202）g，由延边大学动物实验中心提供。实验前7d进行小鼠环境适应，饲养环境为小鼠饮食饮水均自由，光/暗交替12h周期的无病原体环境（温度为2025，湿度为50%70%）。1.3实验方法1.3.1染毒处理对低、中、高剂量DEHP组和低、中、高剂量DEHP+Pb联合染毒组小鼠饲料进行染毒，以11比例将DEHP与吐温80混合后，按低剂量1.6510-5mLg-1、中剂量3.310-5mLg-1、高剂量6.610-5mLg-1由延边大学动物实验中心对饲料进行染毒加工，对DEHP联合染毒组和Pb组用乙酸铅和双蒸水配制成0.25gL-1于小鼠饮用水染毒。1.3.2实验分组处理将80只小鼠随机分为12周实验组和24周实验组，每组40只。实验组分为正常对照组（CT），Pb组，低剂量（1.6510-5mL/g）DEHP组、中剂量（3.310-5mL/g）DEHP组、高剂量（6.610-5mL/g）DEHP组、低剂量（1.6510-5mL/g）DEHP+Pb组、中剂量（3.310-5mL/g）DEHP+Pb组、高剂量（6.610-5mL/g）DEHP+Pb组，共8组，每组5只。12周/24周染毒组实验分组见表1。1.3.3行为学实验形态观察：染毒期间所有组小鼠均自由进食饮水，每日定期更换染毒饮用水及饲料并观察小鼠的呼吸、状态、毛色、精神状态及体重。Morris水迷宫实验：小鼠连续染毒12周和24周期结束后开始Morris水迷宫训练，为期5d。水迷宫为半径0.6m的圆形水池，水池中安置9cm平台，顶部置有摄