MuRF2、PPAR_γ1和Ub重组质粒的构建及鉴定_范玉成.pdf

3期收稿日期：2022-06-22基金项目：国家自然科学基金项目（81560208；31960177）作者简介：范玉成（1993），男，在读硕士研究生，研究方向：分子法医病理学。通信作者：景丽（1975），女，教授，主要从事分子法医病理学研究。Email：过氧化物酶体增殖物激活受体 （peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR）是核受体超家族中的重要一员1-3。噻唑烷酮类化合物以及布洛芬、芬布芬等非甾体抗炎药物是PPAR 重要的人工合成配体4-5。有研究6-8发现，糖尿病患者发生心肌代谢紊乱与 PPAR 激活及表达增强有关。泛素连接酶肌肉环指状蛋白2（ubiquitin ligase muscle ring finger protein2，MuRF2）是近年发现的心肌横纹肌特异性泛素连接酶9。在心肌组织中，MuRF2 存在于心肌肌小节 M线，与肌联蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白协同完成心肌细胞收缩活动，参与并调控心脏发育和舒缩功能10。本课题组前期研究11-12发现，MuRF2 通过泛素化方式修饰 PPAR 1，其缺失可能导致严重的糖尿病心肌病，而糖尿病心肌病是目前糖尿病患者死亡的一种常见原因13-15。关于 MuRF2 通过泛素化方式修饰 PPAR 1 参与糖尿病心肌病发生的机制尚不清楚，仍需通过适当的载体进行相关研究。本文旨在构建 PPAR 1、MuRF2 和泛素（ubiquitin，Ub）的重组质粒，以 HEK 293T 细胞为工具细胞进行共转染，检测 PPAR 1、MuRF2 和Ub 蛋白的表达及泛素化修饰作用，以期为探讨PPAR 1 和 MuRF2 泛素化修饰作用提供载体。1材料与方法1.1材料与试剂GV146 载体和 GV417 载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司；大肠杆菌感受态细胞DH5 由本实验室制作保存；HEK 293T 细胞由武汉普诺赛生命科技有限公司提供；GeneRuler1 kb DNA Ladder 购自 Thermo Scientific 公司；NormalRunTM250 bp-DNA Ladder 购自 GeneRay公司；Restriction Endonuclease 购自 NEB 公司；PrimeSTARRHS DNA Polymerase 购自 TaKaRa 公司；Taq Plus DNA polymerase 和 ClonExpressTMMuRF2、PPAR 1 和 Ub 重组质粒的构建及鉴定范玉成1，4，徐方晶2，王锐1，何军2，3，景丽1（1.宁夏医科大学基础医学院，银川750004；2.宁夏医科大学临床医学院，银川750004；3.宁夏医科大学总医院，银川750004；4.宁夏医科大学附属石嘴山市第一人民医院病理科，石嘴山753000）摘要：目的构建过氧化物酶体增殖物激活受体 亚型 1（peroxisome proliferator-activated receptor gammaisoform 1，PPAR 1）、泛素连接酶肌肉环指状蛋白 2（ubiquitin ligase muscle ring finger protein 2，MuRF2）和泛素（ubiquitin，Ub）的重组质粒并进行鉴定。方法根据 MuRF2、PPAR 1 和 Ub 的 cDNA 序列及 GV146 和GV417 载体质粒上的多克隆位点设计目的基因克隆引物。XhoI/EcoRI 内切酶分别双酶切 PPAR 1 目的DNA 与 GV146 载体；NheI/BamHI 内切酶分别双酶切 MuRF2 和 Ub 目的 DNA 与 GV417 载体。用连接酶连接双酶切后的目的 DNA 和载体，导入大肠杆菌经筛选获得重组质粒。PCR 鉴定重组克隆后进行 DNA 测序。转染 HEK 293T 细胞后，于荧光显微镜下观察转染效率；免疫共沉淀实验后用 Western blot 检测蛋白的表达及蛋白质相互作用。结果以合成的 PPAR 1、Ub、MuRF2 的引物分别对 PPAR 1、Ub 和 MuRF2 的菌落进行 PCR 扩增，产物大小分别为 943、451 和 1 154 bp，与预期结果一致。测序结果与目的基因序列进行比对分析，证实成功构建出 PPAR 1、Ub 和 MuRF2 的重组质粒。在 HEK 293T 细胞中共转染 His-MuRF2、HA-Ub、PPAR 1 重组质粒，荧光显微镜观察结果提示重组质粒成功转染。免疫共沉淀试验后用 Western blot 检测可见 PPAR 1、MuRF2 和 Ub 蛋白的有效表达，且验证了 MuRF2 介导 PPAR 1 发生泛素化修饰反应。结论成功构建 PPAR 1、MuRF2 和 Ub 的重组质粒，且三种质粒在 HEK 293T 细胞中有效表达，验证了 MuRF2介导 PPAR 1 发生泛素化修饰反应。关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体 亚型 1；泛素连接酶肌肉环指状蛋白 2；泛素；重组质粒；泛素化修饰中图分类号：R346文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.009文章编号：1674-6309（2023）03-0275-07论著范玉成，等.MuRF2、PPAR 1 和 Ub 重组质粒的构建及鉴定第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University275宁夏医科大学学报45卷One Step Cloning Kit 购自 Vazyme 公司；EndoFreemidi Plasmid Kit 购自北京天根公司；质粒提取试剂盒购自Omega公司；LipofectamineTM3000 Reagent购自 Invitrogen 公司；DMEM 培养基和胎牛血清购自 Gibco 公司；PBS 和胰酶购自 BI 公司；全蛋白检测试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒和SDSPAGE 快速凝胶配制试剂盒购于凯基生物公司；PPAR 抗体购自 Cell Signaling Technology 公司；GAPDH 抗体购自博奥森公司；辣根过氧化酶标记的二抗购自北京天根公司；免疫（共）沉淀（IP/CoIP）试剂盒购自爱必信公司；HA 抗体购自碧云天公司。1.2方法1.2.1载体酶切配制 50 L 酶切反应体系，用 100 L 移液枪轻柔吹打混匀，置于 37 恒温箱中反应 3 h。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。1.2.2引物设计与合成根据 PPAR 1、MuRF2和 Ub 的 cDNA 克隆基因序列以及 GV146 和GV417 载体上的多克隆位点，应用 Premier 5.0软件设计目的基因扩增引物（表 1）及菌落 PCR鉴定引物（表 2）。引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。引物引物序列UbF：GAACCGTCAGATCCGCTAGCCGCCACCATGGGCTACCCCTATGATGTGR：GGAGGGAGAGGGGCGGATCTCAACCACCTCTGAGACGGAGGACMuRF2F：GAACCGTCAGATCCGCTAGCCGCCACCATGAGCGCATCTCTGAATTACR：GGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGTGPPAR 1F：TACCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGTTGACACAGAGATGCCR：TACCGTCGACTGCAGAATTCCTAGTACAAGTCCTTG表 1目的基因扩增引物序列表 2菌落 PCR 鉴定引物序列引物引物序列UbF:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGR:AACGCACACCGGCCTTATTCMuRF2F:CAAAACTATCGAGGAATGTTR:AACGCACACCGGCCTTATTCPPAR 1F:TGATATCGACCAGCTGAATCR:AACGCACACCGGCCTTATTC1.2.3PCR 扩增目的基因片段以合成引物进行 PCR 反应，扩增 Ub、MuRF2、PPAR 1 全长基因。PCR 反应体系：5 Primer star buffer 10 L，模板 1 L，上、下游引物（10 mol L-1）各 1 L，dNTP（10 mmol）1 L，Prime star 0.5 L，双蒸水补加至 50 L。PCR 扩增条件：95 预变性 5 min；95 变性 30 s，从 70 开始，以 0.5 为阶梯逐渐降温，以 65 为退火温度，退火时间为 30 s，72 延伸 1 min，共 30 个循环；72 再延伸10 min。PCR 产物经 1 琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.4PCR 产物与载体进行交换及转化于冰水浴中配制反应体系。用 100 L 移液枪轻柔吹打混匀，避免产生气泡。于 37 反应 30 min，随后置于冰水浴中冷却 5 min 后立即转化。于100 L 感受态细胞中加入 10 L 交换反应产物，轻弹管壁数下混匀，置于冰上 30 min。42 热激 90 s，冰水浴孵育 2 min。加入 500 L LB 培养基，置于 37 摇床振荡培养 1 h。取适量菌液均匀涂布在含有卡那霉素的平板上，于 37 恒温培养箱中倒置培养 16 h。1.2.5菌落 PCR 鉴定及基因测序配制 20 LPCR 鉴定反应体系，振荡混匀。在超净工作台中，用无菌的移液枪枪头挑取单个菌落至 20 L 鉴定体系中，吹打混匀，置于 PCR 仪中进行反应。将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含有卡那霉素的 LB 液体培养基中，于 37 恒温箱中培养1216 h，取适量菌液寄送至上海吉凯基因化学技术有限公司进行 DNA 测序分析。对测序结果和目的基因序列进行比对分析确定重组质粒构建成功与否。1.2.6重组质粒转染接种 HEK 293T 细胞至6 孔板内（应尽量保证为单细胞悬液，且消化程度适合，处于良好的生长状态），接种细胞数量约为 3105至 5105细胞/孔，每孔加入 2 mL DMEM完全培养基，置于 37 恒温箱中培养 24 h。转染前需确保细胞密度适宜（汇合度应为 70%80%），状态良好。利用 LipofectamineTM3000Reagent 将 MuRF2、PPAR 1 和 Ub 重组质粒共转染至 HEK 293T 细胞。1.2.7胞内泛素化反应的 Western blot 分析收集细胞，用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，并进行BCA 蛋白定量。取 500 g 蛋白加入 HA 标签抗2763期体 5 L 置于 4 C 冰箱，旋转孵育过夜。加入 5 LProtein A 和 5 L Protein G，置于 4 C 冰箱，旋转孵育过夜后，12 000g，4 离心 1 min，保留沉淀。500 L 1 Wash buffer 清洗沉淀，12 000g，4 离心 1 min，保留沉淀（去除上清时可使用1 mL 注射器，避免吸走沉淀）；重复此步 3 次。加入 30 L 1 SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，涡旋振荡后，微量离心 30 s，以使附着管壁的珠子和液体沉于管底；100 金属浴 15 min，14 000g瞬时离心 1 min，吸取上清液，样品用 Westernblot 检测分析。1.3统计学方法数据的整理和分析采用 SPSS 23.0 统计软件，计量资料以均数标准差（xs）表示，组间比较采用 t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1MuRF2 介导 PPAR 1 发生泛素化修饰本课题组前期研究12提示，MuRF2 通过泛素化方式修饰 PPAR 1，图 1 为自绘的该修饰反应的模拟图。MuRF2 上的多泛素链可作为“着陆垫（landing pads）”，通过 Ub 和 E2 上的 UBD 之间的非共价相互作用来招募多个 E2-Ub 分子。E2-Ub 分子的局部浓度增加允许 MuRF2 发生渐进性泛素化。UbUbUbUbUbUbUbUbUbU