阿魏酸调控肉肌原纤维蛋白氧化及对乳化特性的影响_常海军.pdf

食品与发酵工业 （）：引用格式：常海军，周文斌，谢娜娜，等 阿魏酸调控肉肌原纤维蛋白氧化及对乳化特性的影响 食品与发酵工业，（）：，（）：阿魏酸调控肉肌原纤维蛋白氧化及对乳化特性的影响常海军，周文斌，谢娜娜，冯敏，朱苓（重庆工商大学 环境与资源学院，重庆市特色农产品加工储运工程技术研究中心，重庆，）摘 要 将不同添加量（、）阿魏酸加入到提取的猪肉肌原纤维蛋白中，并以 丁基羟基茴香醚（，）作为阳性对照，冷藏放置不同时间（、）探究阿魏酸对猪肉肌原纤维蛋白的氧化调控、结构变化及乳化特性的影响。结果表明，随着阿魏酸添加量的增加，猪肉肌原纤维蛋白中巯基的含量呈增长趋势，贮藏后期 阿魏酸组和 组与空白对照组相比显著升高（）。而测定组的羰基、自由氨基含量、表面疏水性、内源性色氨酸荧光强度、结构与空白对照组相比都有所下降，且变化最显著是 阿魏酸组（）。乳化活性和乳化稳定性都呈上升趋势，其中第 天时，乳化活性由空白对照组的 上升至 ，乳化稳定性由 上升至 。因此，添加一定量的阿魏酸能有效调控猪肉肌原纤维蛋白氧化，并改善其乳化特性。关键词 阿魏酸；蛋白氧化；肌原纤维蛋白；乳化特性第一作者：博士，副教授（通信作者，：）基金项目：重庆市自然科学基金面上项目（基础研究与前沿探索专项）（）；重庆市教委科学技术研究计划项目（；）收稿日期：，改回日期：肉类在生产、加工和贮藏过程中，由于受到许多结构破坏和氧化促进剂的影响，蛋白质不可避免地暴露在含有氧化应激的环境中，导致肉蛋白质的结构发生改变从而影响肉品的加工性能、风味品质以及营养价值，最终影响制品品质。其中肉蛋白的过度氧化是造成其品质下降的重要原因，不仅影响肉制品感官品质，而且会破坏乳化和凝胶等加工性能。已有研究发现，蛋白适度氧化会导致肌肉蛋白发生去折叠并进一步提高其凝胶性能，而过度氧化会导致共价交联介导的不可逆和不恰当聚集，从而降低蛋白质的凝胶性能。近年来，蛋白氧化的研究越来越受到学者的关注，以植物多酚作为天然抗氧化剂代表，研究其诱导调控肌肉蛋白氧化及对功能特性的影响已成为肉品科学技术领域的研究热点。植物多酚具有优良的抗菌、抗炎和抗氧化等生理功效，广泛存在于中草药、香辛料、水果蔬菜、果皮果渣等农产品加工副产物中，因而备受关注。现有研究表明，在肉制品加工与贮藏过程中，植物多酚具有抑制脂肪氧化、调控肉蛋白氧化程度进而影响蛋白功能特性的作用。阿魏酸（，）是植物多酚中酚酸的一种，是阿魏、当归、川芎、升麻等中药材的有效成分，在医药、化妆品、保健品、食品中有着广泛的应用。具有较强的抗氧化能力，对羟自由基（）和超氧阴离子自由基（）等都有一定的清除能力，因副作用小、价格低且容易获得，阿魏酸在食品营养及医药方面的重要性逐渐凸显出来，其生物学作用成为近年来的研究热点之一，其中最受关注的是抗氧化作用。目前未见有阿魏酸诱导调控肉蛋白氧化及其对乳化特性的影响和相关作用机制研究报道，本文研究了不同浓度阿魏酸对猪肉肌原纤维蛋白贮藏过程中蛋白氧化及乳化特性的影响，研究可为有效调控蛋白氧化程度以及富含酚类的天然植提物在肉制品绿色加工中的科学应用提供理论依据和实际参考。材料与方法 材料与试剂实验所用猪肉为里脊肉，购于重庆市南岸区五公里人人乐超市。（），上海麦克林生化科技有限责任公司；结晶牛血清蛋白（，）为生化试剂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。仪器与设备 高速匀浆器，德国 公司；自动绞肉机，广东省韶关市大金研究报告 年第 卷第 期（总第 期）食品机械厂；荧光分光光度计，日本日立仪器有限公司；傅里叶红外光谱，日本岛津公司；高速冷冻离心机、低速台式离心机，湘仪离心机（长沙）仪器有限公司；紫外可见分光光度计，翱艺仪器（上海）有限公司；电热恒温水浴锅，江星仪器（上海）有限公司；电子天平，日本岛津公司；冰箱，青岛海尔股份有限公司。实验方法 肌原纤维蛋白的提取肉肌原纤维蛋白（，）的提取参考 等的方法，用双缩脲法测定 蛋白浓度，所提取的 于 内使用完。样品制备将提取的 随机分为 组，每组用 缓冲液（含 ，）将 蛋白膏稀释为 。第 组为空白对照组（不添加任何抗氧化剂），第 组添加 阿魏酸，第 组添加 阿魏酸，第 组添加 阿魏酸，第 组添加 丁基羟基茴香醚（，）作为阳性对照。混匀后，置于 冰箱冷藏，分别在第、天测定每组相应指标。氨基酸侧链修饰 羰基含量测定采用二硝基苯肼法进行测定，参照 等的研究方法，并作部分修改，测定方法如下：取 溶液（质量浓度 ）于离心管中，加入 二硝基苯肼。设立空白对照组（加入 溶液），振荡混匀，避光反应，然后添加 （体积分数）三氯乙酸溶液充分振荡以沉淀蛋白并终止反应，于、条件下离心，离心后的黄色沉淀用乙醇和乙酸乙脂混合物（，体积比）洗涤 次。最后一次洗涤后挥干有机溶剂，加入 盐酸胍溶液（），在 的水浴锅中温育。之后于、离心，在波长 测定上清液吸光度，按照公式（）计算羰基含量：羰基含量（蛋白质）反总样（）式中：，处样品的吸光度；，处对照组的吸光度；，比色光径 ；，样品的蛋白质量浓度，；反总，反应体系的总体积；样，样品加入的体积。总巯基含量测定参照熊杰等的测定方法，并作相应的调整，使用，二硫双（硝基苯甲酸）试剂进行测定。取各样品溶液 （浓度 ）置于离心管中，加入 甘氨酸溶液，匀浆后冷冻离心 （，），取上清液 加入 的 试剂混匀，室温 避光静置，然后于 波长处测定吸光度。稀释倍数 。按照公式（）计算总巯基含量：巯基含量（）（）式中：，样品组在波长为 处的吸光值；，分子吸光系数，其值为 （）；，质量浓度，此处为 ；，稀释倍数，此处为 。自由氨基含量测定参照褚千千等的方法，自由氨基的含量利用 试剂测定。液用 缓冲液（）稀释至 ，加入 （质量分数）十二烷基硫酸钠（，）溶液与 的蛋白样液混合均匀，再加入 三硝基苯磺酸，之后在 水浴中避光反应 ，加入 使反应停止，室温下冷却 后测定样品在 处的吸光值。以 亮氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制 亮氨酸在相同条件下的标准曲线，带入样品吸光值即可确定自由氨基含量。肌原纤维蛋白结构分析 二级结构测定参考 等的方法，利用傅里叶变换红外光谱（，）扫描分析蛋白的二级结构。经氧化处理和冷冻干燥后，与 压制成薄片，红外光谱仪扫描范围为 ，分辨率，扫描次数，使用 软件提取蛋白质酰胺 带 波段图谱，对检测得到的数据进行傅里叶去卷积处理，分析蛋白质 螺旋、折叠、转角和无规卷曲等二级结构的变化。内源性色氨酸荧光分析参考 等的测定方法，利用荧光光度仪测定内源性色氨酸荧光强度。样品用 液稀释，使蛋白含量为 ，取 于石英比色皿中在波长 处激发，取波长为 的光谱，电压为 ，扫描速度为 。食品与发酵工业 （）表面疏水性测定参考 等方法并略作修改，利用溴酚蓝法测定。取 （）溶解于 磷酸缓冲溶液（）中。吸取 溶液加入 溴酚蓝（），条件下搅拌混匀，于 离心，用蒸馏水将上清液稀释 倍，于 处测定吸光度；设立空白对照组。表面疏水性可按照公式（）计算：溴酚蓝结合量 对照 样品对照（）式中：对照和 样品分别表示不含蛋白的对照组和样品的吸光度。肌原纤维蛋白乳化活性（，）和乳化稳定性（，）的测定参考邵俊花等的方法并稍作调整，采用浊度法进行测定。用磷酸盐缓冲液将含有不同阿魏酸浓度的 稀释至 。取 的大豆油，再加入配制好的蛋白溶液 ，室温高速均质 ，立即从乳液底部 处取 新制备的乳状液放入离心管中，另加入 溶液，并充分摇匀。于室温下静置 和 后，于波长 处测定吸光值，并记录为 和。用 溶液作为空白对照。和 分别按照公式（）、公式（）计算：（）（）（）式中：为乳化前的蛋白浓度；为乳化液中油的体积分数；代表 处的吸光度值。（）式中：和 分别表示静置 和 后，在 处的吸光度值。数据分析处理所用每组样品设置 个平行组，试验测试重复 次，用平均值 标准偏差（）来表示结果；差异显著（）和极显著（）分析采用 进行 分析所得。采用 和 分析红外光谱。结果与分析 氨基酸侧链修饰 不同浓度阿魏酸对冷藏肌原纤维蛋白羰基含量的影响羰基是反映蛋白质变性的重要标志性物质，其形成是由于氧化过程中蛋白肽键发生断裂，以及一些带有 或 的氨基酸侧链受活性氧的攻击，羰基值的高低可以间接地反映蛋白被氧化的程度。在 贮藏期内，羰基的含量总体呈上升趋势，说明蛋白质的氧化程度也有所增加。贮藏第 天时，、阿魏酸组羰基含量极显著低于空白组（）；贮藏第 天时，随着阿魏酸浓度的增加，羰基含量逐渐减少，且阿魏酸组的羰基值均极显著低于空白对照组（）。这说明随着贮藏时间的延长，添加一定浓度的阿魏酸能有效地抑制 的氧 化，尤 其 是 添 加 阿 魏 酸 与 添 加 具有同等的抗氧化效果，这可能与阿魏酸具有较强的清除自由基和鳌合金属能力有关。图 不同浓度阿魏酸对冷藏肌原纤维蛋白羰基含量的影响 注：不同小写字母表示同一贮藏时间各处理组差异显著（），不同大写字母表示同一贮藏时间各处理组差异极显著（）（下同）不同浓度阿魏酸对冷藏肌原纤维蛋白总巯基含量的影响由于蛋白半胱氨酸中的巯基属于活性巯基，容易发生氧化形成二硫键，贮藏期巯基含量降低，因此也可用巯基的损失来判断蛋白质的氧化程度。由图 可知，巯基量总体呈现减少的变化趋势，说明蛋白质受活性氧影响促使巯基逐渐转变为二硫键，导致蛋白氧化程度越来越大。贮藏第 天时，、阿魏酸组巯基含量均显著高于空白对照组（）；贮藏第 和 天时，、阿魏酸组巯基含量均极显著高于空白对照组（）。这说明阿魏酸和 在贮藏的中后期能够在一定程度上抑制蛋白质氧化，从而降低巯基的损失。并且贮藏期间添加 阿魏酸抑制 巯基损失效果与添加同浓度的 接近，说明阿魏酸的抗氧化能力与 接近。这与李玲等研究报道的添加 茶多酚可有效抑制蛋白巯基损失的结论一致，说明阿魏酸和茶多酚一样可保护 侧链基团。研究报告 年第 卷第 期（总第 期）图 不同浓度阿魏酸对冷藏肌原纤维蛋白总巯基含量的影响 不同浓度阿魏酸对冷藏肌原纤维蛋白自由氨基含量的影响多酚物质在清除自由基后，会转化为醌或半醌物质，这类物质能够进一步与蛋白质的氨基发生加合反应得到“氨基醌”加合物，从而降低蛋白质中自由氨基含量。图 表明，在 贮藏期内，自由氨基含量总体呈增加趋势，这可能是由于蛋白质氧化发生脱氨基作用，使得蛋白质中的自由氨基含量增加。贮藏第 天时，添加阿魏酸和 组的自由氨基含量均显著低于空白对照组（）；贮藏第 天时，、阿魏酸组自由氨基含量极显著低于空白对照组（）；贮藏第、天时，均随着阿魏酸浓度增大，自由氨基含量逐渐减少，且 、阿魏酸组自由氨基含量均显著低于空白对照组（）。在贮藏过程中，添加 后 中的自由氨基的量都降到最低。由此说明添加阿魏酸和 后导致自由氨基含量降低，可能与酚类物质与自由氨基发生加成反应产生“氨基醌”加合物有关。与此类似，曹云刚研究表明，肉蛋白中加入绿原酸可被氧化生成醌或半醌类物质，再与氨基共价结合，形成“氨基醌”共价化合物，最终导致自由氨基含量的降低。因此，添加阿魏酸能在一定程度上与蛋白质氨基发生共价结合，降低蛋白质中自由氨基的含量。肌原纤维蛋白结构分析 不同浓度阿魏酸对冷藏肌原纤维蛋白二级结构的影响蛋白质红外图主要反映的是蛋白质酰胺带和带上特征官能团的振动，对样品定性起到尤为重要的作用。蛋白质二级结构的 个主要指标（折叠、无规则卷曲、螺旋和 转角）与蛋白质吸收峰的分布具有一定的关系，通过酰胺 带最大峰波数就能分析出蛋白质中二级结构的分布情况。由图 可知，折叠是 二级结构的主要结构，其次是螺旋。随着阿魏酸浓度的增加，中 折叠和 转角两者呈现降低的趋势，螺旋和无规则卷曲两者呈现升高趋势。因此阿魏酸可促进蛋白二级结构中的 折叠和 转角向 螺旋和无规则卷曲转变。这可能是因为阿魏酸含有的多个羟基破坏了维持型结构稳定的氢键，使得多肽羰基中氢键网络结构发生重排和 螺旋结构还原。已有研究表明蛋白氧化会促使 螺旋结构向 结构或无规则卷曲结构转变，导致 螺旋结构损失。因此，阿魏酸可有效阻止蛋白氧化，进而保护 螺旋结构。图 不同浓度阿魏酸对冷藏肌原纤维蛋白自由氨基含量的影响 图 不同浓度阿魏酸处理肌原纤维蛋白 图谱 不同浓度阿魏酸对冷藏肌原纤维蛋白内源性