β-桧木醇联合替加环素对t...大肠杆菌的体外协同抗菌作用_张慕琛.pdf

张慕琛 等/-桧木醇联合替加环素对 tet(X4)阳性大肠杆菌的体外协同抗菌作用 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1621-1632 DOI:10.13345/j.cjb.220612 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：岭南现代农业实验室科研项目(NT2021006)；国家自然科学基金(31930110)This work was supported by the Laboratory of Lingnan Modern Agriculture Project(NT2021006)and the National Natural Science Foundation of China(31930110).#These authors contributed equally to this work.*Corresponding author.E-mail: Received:2022-08-03;Accepted:2023-02-22 1621 生物工程学报 -桧木醇联合替加环素对 tet(X4)阳性大肠杆菌的体外协同抗菌作用 张慕琛1,2#，宋黄威1,2#，邹之宇1，杨思源1，李会3，代重山1,2，刘德俊1,2，邵兵3，吴聪明1,2，沈建忠1,2，汪洋1,2*1 中国农业大学动物医学院 农业农村部动物源细菌耐药性监测重点实验室，北京 100193 2 岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东 广州 510642 3 北京市疾病预防控制中心，北京 100013 张慕琛,宋黄威,邹之宇,杨思源,李会,代重山,刘德俊,邵兵,吴聪明,沈建忠,汪洋.-桧木醇联合替加环素对tet(X4)阳性大肠杆菌的体外协同抗菌作用J.生物工程学报,2023,39(4):1621-1632.ZHANG Muchen,SONG Huangwei,ZOU Zhiyu,YANG Siyuan,LI Hui,DAI Chongshan,LIU Dejun,SHAO Bing,WU Congming,SHEN Jianzhong,WANG Yang.Synergistic effect of-thujaplicin and tigecycline against tet(X4)-positive Escherichia coli in vitroJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1621-1632.摘 要：质粒介导 tet(X4)基因的出现和流行，严重影响替加环素(tigecycline)对临床多重耐药细菌感染的治疗效果，急需寻找有效的佐剂遏制替加环素耐药性。本研究采用微量棋盘稀释法、时间-杀菌曲线测定-桧木醇(-thujaplicin)和替加环素的体外联合抗菌表征，通过测定细菌细胞膜通透性、细菌胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量、铁含量以及替加环素含量等指标，来探究-桧木醇和替加环素联合使用对 tet(X4)基因阳性大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌作用机制。结果表明，-桧木醇联合替加环素对 tet(X4)基因阳性大肠杆菌具有体外协同抗菌效果，且-桧木醇在抗菌作用浓度范围内无显著溶血性和细胞毒性。机制研究发现，-桧木醇能显著增大细菌细胞膜的通透性，降低细菌胞内铁含量，干扰铁稳态，诱导细胞内 ROS 显著增加，从而发挥抗菌效果。进一步研究发现，-桧木醇可通过干扰细菌铁代谢和增大细菌细胞膜通透性，协同增强替加环素的抗菌效果。本研究结果为-桧木醇联合替加环素治疗 tet(X4)基因阳性大肠杆菌感染提供了理论和实践基础。关键词：-桧木醇；替加环素；tet(X4)；协同抗菌；铁稳态 医药生物技术 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1622 Synergistic effect of-thujaplicin and tigecycline against tet(X4)-positive Escherichia coli in vitro ZHANG Muchen1,2#,SONG Huangwei1,2#,ZOU Zhiyu1,YANG Siyuan1,LI Hui3,DAI Chongshan1,2,LIU Dejun1,2,SHAO Bing3,WU Congming1,2,SHEN Jianzhong1,2,WANG Yang1,2*1 Key Laboratory of Animal Antimicrobial Resistance Surveillance,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,College of Veterinary Medicine,China Agricultural University,Beijing 100193,China 2 Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture,Guangzhou 510642,Guangdong,China 3 Beijing Center for Disease Prevention and Control,Beijing 100013,China Abstract:The widespread of tigecycline resistance gene tet(X4)has a serious impact on the clinical efficacy of tigecycline.The development of effective antibiotic adjuvants to combat the looming tigecycline resistance is needed.The synergistic activity between the natural compound-thujaplicin and tigecycline in vitro was determined by the checkerboard broth microdilution assay and time-dependent killing curve.The mechanism underlining the synergistic effect between-thujaplicin and tigecycline against tet(X4)-positive Escherichia coli was investigated by determining cell membrane permeability,bacterial intracellular reactive oxygen species(ROS)content,iron content,and tigecycline content.-thujaplicin exhibited potentiation effect on tigecycline against tet(X4)-positive E.coli in vitro,and presented no significant hemolysis and cytotoxicity within the range of antibacterial concentrations.Mechanistic studies demonstrated that-thujaplicin significantly increased the permeability of bacterial cell membranes,chelated bacterial intracellular iron,disrupted the iron homeostasis and significantly increased intracellular ROS level.The synergistic effect of-thujaplicin and tigecycline was identified to be related to interfere with bacterial iron metabolism and facilitate bacterial cell membrane permeability.Our studies provided theoretical and practical data for the application of combined-thujaplicin with tigecycline in the treatment of tet(X4)-positive E.coli infection.Keywords:-thujaplicin;tigecycline;tet(X4);synergistic antibacterial effect;iron homeostasis 多重耐药革兰阴性菌的出现及蔓延严重威胁人类和动物健康1。替加环素作为第 3 代四环素类(甘氨酰环类)药物，由于其抗菌谱广且耐药率低，被认为是治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线2。早期研究发现，非特异性外排泵过表达、核糖体保护以及药物修饰酶 Tet(X)均能介导细菌对替加环素产生耐药，但这些耐药基因大多不能水平传播3-4。其中，Tet(X)是黄素依赖单加氧酶，能对四环素类药物分子的 C11a位点进行羟基化修饰，从而导致该类药物(包括替加环素)失活5。2019 年，我国两个研究团队发 现了 2 种 tet(X)基因变 异体：tet(X3)和tet(X4)6-7。令人担忧的是，tet(X3)和 tet(X4)基因多位于接合型质粒上，可在不同种属细菌间进行水平传播。后期研究陆续发现，tet(X4)基因已经在人、环境、畜禽等多种来源的细菌中广泛存在，且大肠杆菌是携带 tet(X4)基因的主要病原菌8-10。tet(X4)基因的广泛流行加剧了替加环素 张慕琛 等/-桧木醇联合替加环素对 tet(X4)阳性大肠杆菌的体外协同抗菌作用 ：010-64807509： 1623 耐药性的蔓延，给人医临床上替加环素治疗多重耐药菌感染的疗效造成了巨大挑战。因此，急需开展针对替加环素耐药性的控制措施。抗菌药物是治疗细菌感染的重要手段。然而，目前新型抗生素开发面临研发难度大、成本高、周期长等困境11。由于抗生素佐剂能恢复甚至增强抗生素的抗菌效果，从而延长现有抗菌药物使用寿命12。因此，开发安全有效的替加环素佐剂已成为遏制其耐药性发展的重要策略之一。例如，Liu 等13发现抗人类免疫缺陷病毒药物齐多夫定(azidothymidine)可与 Tet(X)活性位点特异性结合并抑制其催化活性，从而恢复tet(X)基因阳性菌对替加环素的敏感性。此外，Xu 等14发现从白花丹中分离的萘醌类天然化合物兰雪醌不仅可破坏细菌细胞膜的完整性，还能与 Tet(X3)和 Tet(X4)活性中心结合，抑制 Tet(X3)和 Tet(X4)的催化活性，从而恢复 tet(X4)基因阳性菌对四环素类药物的敏感性。以上研究表明，开发替加环素佐剂具备理论和实践上的可行性。但目前尚未有替加环素佐剂成功进入临床应用，因此急需进一步开发。由于结构和功能具有丰富的多样性，来源于植物的天然化合物在药物开发中发挥着巨大作用，已备受各国科学家的关注15。本研究通过对天然化合物库进行高通量筛选，发现-桧木醇(-thujaplicin)联合替加环素对携带 tet(X4)基因的大肠杆菌具有较好的协同抗菌效果。-桧木醇是从中国台湾扁柏的树干中提取的一种具有卓酚酮骨架的单萜类天然化合物，具有